202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására
11 HU 202276 B 12 észter-módszerével [Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 75, 5765 (1978)], és ezt használjuk fel helyspecifikus mutagenezishez: 2C9 primer minta DNS szekvencia: G CCT CAG TTT Glu GAA ATC AAA GGA G Adelman és munkatársainak általános módszerét [DNS 2, 183 (1983)], amelyet ebbe a bejelentésbe referenciaként építettünk be, alkalmazzuk a szintetikus primer minta mutált szekvenciáját tartalmazó t-PA klón kialakítására. Az M13RF2C9 mutáns t-PA kiónt a fentebb bemutatott egyedi aminosavnál levő mutációt tartalmazó primer minta alkalmazásával alakítjuk ki. A pPADHFR-6 plazmidban (amelyet pETPFR-nek is hivnak, lásd a fentebb idézett 93 619 közzétételi számú Európa szabadalmi bejelentést) a natív t-PA strukturgén kifejeződése az SV40 T-antigénhez tartozó korai promoter szabályozása alatt áll. Ez a promoter szabályozza a DHFR gén kifejeződését is 1. vektor-fragmenst kapunk a pPADHFR-6-nak BglII-vel és BstEII-vel végzett emésztésével kialakult nagy fragmenst izolálva. 2. fragmenst kapunk a pPADHFR-6- -ot BglII-vel és BstXI-gyel emésztve, és a 400 bázispáros t-PA fragmenst izolálva. Az 1141 bázispáros 3. t-PA fragmenst, amely a kívánt mutációt tartalmazza, az M13RF2C9 mutánst t-PA klón RF DNS-ének BstXI-gyel és BstEII-vel végzett emésztésével kapjuk. A DNS keveréket alkalmazzuk E. coli transzformálására, a pPADHFR-6 2C9 eukarióta kifejeződő vektort kapva. A pPADHFR-6 2C9 plazmid, amelyet i fentebbiekben leírtak szerint és a 199 574. számon közzétett Európa szabadalmi bejelentés szerint (közzétéve 1986. október 29-én) készítünk, egy olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely a glutaminsav27s szöveti típusú plazminogén aktivátor mutánst kódolja. Ezt Scal-gyel és Apai-gyei emésztjük, éB a mintegy 630 bp-s fragmenst, amely a szöveti típusú plazminogén aktivátor DNS szekvenciája 254-466. kodonjainak felel meg, SDS-PAGE-val emésztjük önmagában ismert módon. A két fragmenst, a BglII-Scal (pUCPA HD)-fragmenst és Scal-Apal (pPADHFR-6 2C9) fragmenst az emésztett pUCPA HD-ból kapott nagy BglII (531 bp)-ApaI (1926 bp) fragmensbe ligáljuk, éB az így keletkezett, glutaminu7glutaminsav275 t-PA mutáns DNS-t magában foglaló plazmidot mini-átvizsgálásnak (minisereen) vetjük alá szokásos módon (vö: Maniatis etc., Molecular Cloning: A laboratory Manúal, Cold SpringB Harbor, 1982). Az így létrejött plazmidot DHFR-hiányog CHO sejtekbe vezetjük be és ezekben sokszorozzuk, amint ezt fentebb leírtuk, és a megfelelő t-PA mutánsokat felhasználásra elkülönítjük. 4. példa A t-PA aminosav-szekvenciája 4 potenciális N-kapcsolt glikozilező helyet foglal magában [Asn-X-Ser/Thr; Ann. Rev. Biochem. 41, 673 (1972)]. Ezek a 117., 184., 218., és 448. aszparagin gyökök [Nature, 301, (1983)]. A 218. helyről azonban úgy találták, hogy nem glikozilezett a t-PA-ban. A 184. hely az I. típusú t-PA-ban glikozilezett, de a II. típusú t-PA-ban nem [Biochemistry 23, 3701 (1984)]. A pronázzal emésztett rt-PA gélszűréses kromatográfiája az N-kapcsolt oligoszacharidok két osztályát tárja fel. A nagyobb molekulatömegű anyag összetétele egybevág a fukozilezett komplex típusú oligoszachariddaL A kisebb molekulatömegü anyag egy kis, nagy mannóztartalmú oligoszacharidhoz (valószínűleg MansGlcNAc2) tartozó várt összetétellel rendelkezik. A nagy mannóz tartalmú oligoszacharid kapcsolási helyét a különböző fajlagosságú glikozidáz enzimek alkalmazásával határozzuk meg. Az alkalmazott enzimek az endo-ß-N-acetil-glükóz-amidináz H (Endo Hj Genzyme, Inc.), amely eltávolítja mind a nagy mannóztartalmú, mind a komplex típusú oligoszacharidokat. Az ezekhez a kísérletekhez alkalmazott t-PA-t átalakítjuk plazminnal a kétláncú formára, majd redukáljuk és karboximetilezzük. Az SDS-PAGE szétválasztja a redukált, karboximetilezett kétláncú rt-PA szekvenciából a Kringle I (glikozilezés a 117. és 184. helyen), Kringle II (glikozilezés a 117. helynél) és proteáz (P, glikozilezés a 448 helynél) tartományokat. A t-PA N-glikanázzal való emésztése a Kringle-csikoknak összeolvadását eredményezi egy olyan helyen, ahol a mobilitás valamivel nagyobb, mint a Kringle II-nél, és egyúttal a proteáz nagyobb mobilitását is magéval vonja (2. ábra, 2. sáv). A t-PA Endo H-val történő emésztése növeli mindkét Kringle esik elektroforézises mobilitását, de nem befolyásolja a proteáz-csikét (2. ábra, 4. sáv). Az Endo H-val való emésztés eredménye azt mutatja, hogy mind a Kringle I, mind a Kringle II nagy mannóztartalmú oligoszacharidot tartalmaz; ennek a 117. helynél kell lennie, mert ez az egyetlen glikozilezett hely a Kringle I és Kringle II típusú tartományban. Az Endo H kezelés nem alakítja át a Kringle I típust Kringle Il-vé, ezért a 184. csoport, amely a Kringle I típusban glikozilezve van, de a Kringle II típusban nincs, komplex oligoszacharidot tartalmaz. A 448. helynek szintén komplex szerkezetet kell tartalmaznia, mivel az N-glikanázos kezelés növeli az rt-PA proteáz-részének mobilitását, mig az Endo H-nak nincs hatása. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
