202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására
9 HU 202276 B 10 D. A GLN117 t-PA mutáns szubklónozása pUCPA&HD kifejeződő plazmidba Az M13/t-PA-SMA-GLN117 fég kettős szálú DNS-t emésztjük Smal-gyelt BglII-vel éB Apel-gyel, és a mintegy 1,4 kb-s fragmenst tisztítjuk PAGE-vel. Ezt a fragmenst használjuk azután a megfelelő fragmens helyettesítésére pUCPAaHD-ben. A t-PA -gén fragmenst tartalmazó rekombináns plazmidot azonosítjuk. Az Ml 19 és Q117 plazmidokat bevezetjük DHFR-hiányos CHO sejtekbe [Urlab és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. 77, 4216 (1980)], és sokszorozzuk ebben a következőképpen: 1.) a plazmid DNS-t bevezetjük a sejtekbe a Graham és munkatársai által leirt kalcium-foszfátos kicsapási módszerrel [J. Virol. 52, 455 (1973)]; 2.) a szelektív tápközegben [hipoxantint, glicint és timidint nélkülöző (-HGT) tápközeg] keletkező telepeket t-PA kifejeződésre mérjük közvetlenül a plazmin-képzödés kimutatásával, amint ez fibrin emésztésével fibrint és plazminogént tartalmazó agarlemezen felbecsülhető a Granellia és munkatársai által leirt módszerrel [J. Exp. Med. 148, 223 (1978)]; 3.) a legerősebben pozitív kiónok közül ötöt kvantitativan mérünk a sejt által kiválasztott t-PA mennyiségére, ELISA eljárást alkalmazva; 4.) a legmagasabb szinten t-PA-t kiválasztó kiónt metotrexát (MTX) lemezekre helyezzük a következőképpen: 2 x x 10s sejtet helyezünk 100 mm-es lemezekre, amelyek 50, 100 vagy 250 nmól/1 MTX-et tartalmaznak; 5 kiónt, amelyek az MTX-en megjelennek, extrahálunk és kvantitativen mérjük (ELISA-val), mint fentebb 3. lépésben; 6.) a t-PA-t legmagasabb szinten kiválasztó kiónt nagyobb MTX koncentrációkra helyezzük, mint a fenti 4. pontban, ezt követi öt, ezen is megjelenő klón kvantitatív mérése, és a t-PA-t legmagasabb szinten termelő klón szelektálása. A fenti sokszorozási és átvizsgálási eljárást addig ismételjük, amíg további növekedést már nem kapunk a t-PA termelésben az Így létrejövő sejtvonalban, majd a megfelelő t-PA-termeló mutánst felhasználáshoz elkülönítjük. 2. példa Hasonló eljárást, mint amelyet az 1. példában leirtunk, alkalmazunk a megfelelő Metiu mutáns elkészítésére, az 5’CC-AAC-TGG-AAC-AGC-A*T*G*-GCG-TTG-G-3’ szekvenciával rendelkező 24-mert (M119 24-mer) alkalmazva, Így kapjuk a pUCPAaHD M119-et. A megfelelő Ml 19 mutáns termelését kifejeződéssel az 1. példában leirt módszerrel végezzük. 3. példa GlutaminnTglutaminsavzrs t-PA mutánst készítünk a következő módon: A fentebb leírtak szerint készített pUCPAaHD plazmidot emésztjük BglII-vel és Scal-gyel, és a szöveti típusú plazminogén DNS szekvencia 1-254 kodonjainak megfelelő mintegy 763 bp fragmenst SDS-PAGE-val tisztítjuk önmagában ismert módon. A humán t-PA DNS-t a pPADHFR-6 (más néven pETPFR) plazmidból és a pA25E10 plazmidból kapjuk. Ennek a két t-PA plazmidnak az előállítását a korábban már idézett 093 619. bejelentési számon közzétett Európa szabadalmi bejelentés Írja le, ez a bejelentés - mint említettük - referenciaként van beépítve a jelen bejelentésbe. A pA25E10 a t-PA gén utolsó 508 aminosavát és a 3’-ét nem fordított terület 772 bázispárját kódoló szekvenciákat tartalmazza. Ezt a plazmidot Sacl-gyel és BglII-vel emésztjük, 744 bázispáros fragmenst állítva elő, amelyet standard módszerekkel izolálunk, amint korábban leírtuk. Ez a fragmens tartalmazza & t-PA 411-527. aminosavai közti területéhez tartozó kodonokat, és magában foglalja a 3’ le nem fordított terület egy részét. A pPADHFR-6 plazmid tartalmazza a t-PA-hoz tartozó teljes strukturgént és a 3’ le nem fordított terület egy részét. Ezt a plazmidot Sacl-gyel és BglII-vel emésztjük, igy egy 1230 bázispáros fragmenst állítunk elő, amelyet izolálunk. Ez a fragmens tartalmazza a t-PA érett formájának első 410 aminosavához tartozó kodonokat. Ezeket a fragmenBeket ligáljuk egymással standard módszereket alkalmazva, és BglII-vel emésztjük. A teljes érett t-PA szekvenciához tartozó kodonokat és a 3* le nem fordított terület egy részét tartalmazó 1974 bázispáros fragmenst izoláljuk. A kettős szálú M13mp8-at [MesBing és munkatársai: .Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA* (A Makromolekuláris Rekombináns DNS-ek III. Clevelandi Szimpóziuma), szerkesztő: Walter A., kiadó: Elsevier, Amszterdam (1981), 143. oldal] BamHI-gyel emésztjük és BglII-vel emésztett t-PA-val ÖBBzeforrasztjuk, az M13mp8PABglII-t alkotva meg. E. coli JM101 sejteket (ATTC 33876) transzformálunk az M13mp8PABglII kettős szálú, replikatív formájával. Az M13mp8PABglII egyszálú és kettős szálú (RF) formáit izolálhatjuk az ezzel a fággal fertőzött E. coli JM101 sejtekből. Az egyszálú formát használjuk a t-PA helyspecifikus mutageneziséhez. A humán t-PA strukturgént helyspecifikus mutagenezissel módosítjuk, hogy olyan t-PA-t fejezzen ki, amelyben különböző helyeken aminosav-helyettesitések vannak. Szintetikus oligonukleotidot készítünk pl. Crea és munkatársai szilárd fázisú foszfotri-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
