202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására
7 HU 202276 B 8 117. helyzetnél( és/vagy szerintól (Ser) vagy treonintól (Thr) eltérő aminosavgyökkel a 119. helynél, vagy prolinnal (Pro) a 118. helynél. A legelőnyösebb kiviteli módban az aszparaginm glutaminnal van helyettesítve, szoros szerkezeti hasonlóságukra tekintettel, vagy a szeriniu metioninnal van helyettesítve analóg szekvenciájukra való tekintettel a Kringle II tartományban. A mutagenezist önmagában ismert technikákkal hajtjuk végre, pl. a Zoller és munkatársai által közölt összefoglaló munka szerint [Methods in Enzymology 100, 468 (1983)]. így pl. az aszparagint kódoló AAC kodon megváltoztatásával a 117. helyzetnél CAA-ra vagy CAG-ra, amely két nukleotid változást igényel; a kifejeződési termék glutamint fog tartalmazni a 117. helyzetnél. Más, itt tervezett mutációk is a genetikai kód elemzéséből következnek. Egy másik módszer a szénhidrát-funkció eltávolítására a 117. aminosavgyöknél magában foglalja valamely endoglikozidáz, pl. az Endoglikozidáz H alkalmazását, amely (lényegében) képes eltávolítani a nagy mannóz-tartalmú, szénhidrát-szerkezetű funkciÓB csoportot a 117. aminosav-gyöknél (Asn) anélkül, hogy működését befolyásoló módon hatna a 184. és 448. aminosav-gyököknél levő komplex szerkezetekre. Ezt a kezelést szintén önmagában ismert technikákkal hajtjuk végre, pl. Tarentino és munkatársai [J. Bioi. Chea. 249, 811 (1974)] vagy Trimble és munkatársai [Anal. Biochem. 141, 515 (1984)] módszerével. B. Példák 1. példa Helyspecifikus mutagenezist alkalmazunk, hogy a 117. helynél glutaminsav-gyökkel rendelkező szöveti típusú plazminogén-aktivátort kódoló DNS-t működőképesen magában foglaló kifejeződő vektort kapjunk. A. Oligonukleotid tervezése 5'-TGC-ACC-AAC-TGG-C*A*A*-AGC-AGC-GCG-3' szekvenciával rendelkező 24-mer oligonukleotidot (Q-117) szintetizálunk Crea és munkatársai [Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980)] foszfotriészter módszerével. A csillagok jelzik a mutáns (asn helyett gin) kodont. B. Rekombináns M13 templát megalkotása A pUCPAaHD plazmid (3. ábra) a pETPFR-nek nevezett plazmid (vagy másképpen pPADHFR-6-nak nevezett plazmid, amely a fentebb idézett EPO 93619 Európa közrebocsátási iratban szerepel) származéka a következő módosításokkal: 1.) Az 5’ le nem fordított 166 bázispáros (bp) DNS-t levágtuk a t-PA gén 5’ végéről Bal 31 exonukleázt alkalmazva; 2.) HindlII helyet adtunk a t-PA gén új 5’ végéhez; 3.) EcoRI, SacI, Smal, BamHI, Xbal, Sáli és PvuII számára felismerő helyeket tartalmzó többfunkciós kapcsolót (poiilinker) adtunk az SV40 korai promotor, amely a t-PA kifejeződését elősegíti, 5' végéhez; 4.) a pETPFR 3539. helyénél levő HindlII helyet elroncsoltuk Klenow betöltési reakcióval. A pUCPAaHD plazmidot (3. ábra) Smal-gyel emésztjük, és a mintegy 2,0 kb-s fragmenst, amely az 507. kodontól a t-PA gént tartalmazza, PAGE-val és a fragmensnek a gélről való elektroelúciójával izoláljuk. M13mpl0 vektort [Messing: Methods in Enzymology 101, 20 (1983)] szintén Smal-gyel emésztünk, egyszer fenollal, egyszer kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és újra szuszpendáljuk 50 mmól/1 triszt-t (pH 8,0) és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban (TE oldat). A pUCPAaHD-ból származó mintegy 2,0 kb-s fragmenst az Smal-gyel hasított M13mpl0-be ligáljuk T4 DNS ligázt alkalmazva, és az Így létrejött DNS-t alkalmazzuk E. coli MJ101 törzs transzformálására. Az Így létrejött fágot izoláljuk éB a beiktatás jelenlétét igazoljuk és ennek orientációját meghatározzuk fág mini-preparátumok restrikciós elemzésével. Egy rekombináns fágot, az M13/t-PA-SMA-t, kiválasztunk, mint templátot az ez után következő mutagenezishez. C. Mutagenezis reakció A 24-mer Q117 mutagenezis mintát (primer) összeforrasztjuk egyszálú M13/t-PA-SMA DNS-sel, és E. coli DNS polimeráz Klenow fragmenBsel kezeljük a dNTP-k éB T4 DNS ligáz jelenlétében, hogy in vitro heteroduplex RF molekulákat alkossunk meg, ahogyan ezt Adelman és munkatársai [DNA 2, 183 (1983)] leírták. Ezeket a molekulákat használjuk E. coli JM101 törzs (ATCC 33876) törzs transzformálására, és a kívánt mutációt beépítő fágot tarfolthibridizálással mutatjuk ki, a mutagenezis prímért alkalmazva vizsgáló mintaként [Adelman és munkatársai: DNA 2, 183 (1983)]. Egy mutáns f&got izolálunk, ezt M13/t-PA-SMA-GLN117-nek nevezzük el. 5 10 15 20 25 30 35 40 46 50 55 60 6
