202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására
5 HU 202276 B 6 Man V Man' Man Man—>4 GlcNac—^4 GlcNac—^ASN Man—>2 Man mig a szénhidrát-szerkezet a 184. és 448. aminosav-gyököknél a kővetkező összeállítású: Sia 2—>3 Gal—>4 GlcNac —^2 Man 3 Sia 2—>3 Gal—GlcNac 2 / Man / ahol a rövidítések jelentése az alábbi: Man: mannóz, Gal: galaktóz; Fuc: fukóz; GlcNAc: N-acetil-glükózamin; Sia: sziálsav; R: H vagy Sia2 — 3Gal — 4GlcNac. Hangsúlyozni kell, hogy bár a fenti 35 szerkezetek a humán szöveti típusú plazminogén aktivátoron talált N-kapcsolt oligoszacharidok típusainak képviselői, a jelen találmány nem korlátozódik a csak fentebb bemutatott szerkezetekre. Mindegyik glikozilezési 40 hely valószínűleg számos közeli rokonságban levő, nem azonosított szerkezetet tartalmaz. Ez ismeretes mikroheterogenitásként és a glikoprotein glikánok közös jellemzője [Lásd pl. J. Bioi. Chem. 260, 4046 (1985)]. így pl. 45 nagy mannóz tartalmú oligoszacharidok változhatnak a jelenlevő manmt-egységek számában. A komplex oligoszacharidokban a mikroheterogenitás különbségekkel járhat az elágazások mértékében, valamint a sziálsav, 50 fukóz, galaktóz és N-acetil-glükóz-amin gyökök számában. Az ilyen mikroheterogenitásokat a jelen találmány oltalmi körén belül levőnek tekintjük. A 117. aminosavnál levő, nagy mannóz 55 tartalmú szerkezet egyedinek bizonyul, nem csupán a 184. és 448. aminosav-gyököknél levő Bókkal komplexebb szerkezetből eredően, hanem abban is, hogy ennek a funkciós csoportnak a teljes eltávolítása a 184. és 448. 60 helynél levő szerkezetek ezzel járó funkcionális módosítása nélkül egy teljes biológiai aktivitású humán szöveti plazminogén aktivátort eredményez, amely megnövekedett in vivo félélettartammal bir. 65 6 Man-» 4 GlcNAc^» 4 GlcNac —» ASN A szénhidrát szerkezetű funkcionális csoport eltávolítása a 117. aminosav-gyöknél jelenthet teljes eltávolítást, mint amikor a glikozilezési jelet elroncsoljuk helyre irányuló mutagenezissel, amint ezt később leirjuk, vagy jelenthet jelentős eltávolítást, amely pl. endoglikozidázos kezelésnél történik, amely érintetlenül meghagy egy N-acetil-glükózamin-gyököt az Asmn-hez kötve. A módosítatlan szénhidrát funkciós csoportok a 184. és/vagy 448. aminosav-gyököknél vagy az érintetlen szerkezetiek) megtartását jelenti, vagy az összes ilyen szerkezet lényegében teljes megtartását, úgy, hogy ezek a csoportok funkcionálisan ekvivalensek a natív fehérje megfelelő csoportjaival. Az előnyös kiviteli módban a szénhidrogén szerkezetű funkciós csoport eltávolítását a 117, aminosav-gyöknél az Asn-X-Ser/Thr glikozilezó jel (ahol X jelentése bármelyik aminosav lehet) alapját képező DNS-nek hely-specifikus mutagenezisével hajtjuk végre. A szöveti típusú plazminogén-aktivátor esetében ezt a jelet képviselő szekvencia az AsnuT(Senu)Seru9. A szénhidrát szerkezetű funkciós csoport eltávolítása a 117. aminosav-gyöknél pl. úgy jön létre, hogy ezeknek az amino8av-gyököknek megfelelő kodonokat a mutagén módszerekkel megváltoztatjuk, elroncsolva a jel működőképességét. Részletesebben a mutageneziBt végre lehet hajtani a jelet képviselő kodonokon úgy, hogy pl. olyan humán szöveti típusú plazminogén aktivátor keletkezzék, amely aszparagintól (Asp) eltérő aminosavgyökkel rendelkezik a 5
