202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására
3 HU 202276 B 4 gében a teljes bilógiai aktivitást és ugyanakkor megnövekszik az in vivo félélettartam. A jelen találmány tehát olyan új humán szöveti típusú plazminogén aktivátorokra irányul, amelyek mentesek szénhidrát-szerkezetű funkciós csoportoktól a 117. aminosav-helyen, egyébként viszont módosítatlan szénhidrát-szerkezetekkel bíró funkciós csoportokkal rendelkeznek (a 184. és/vagy 448. aminosav-gyököknél), és megőrzik lényegében teljes biológiai aktivitásukat, ugyanakkor megnövekedett in vivo félélettartammal rendelkeznek (összehasonlítva a .nativ* humán szöveti típusú plazminogén-aktivátorral, amelynek ép szénhidrát-szerkezete van a 117. aminosav-gyöknéL A jelen találmány továbbá olyan biológiailag aktív humán szöveti típusú plazminogén aktivótor ekvivalensekre is irányul, amelyek egy vagy több aminosavban különböznek a teljes szekvenciától, de azonos szénhidrogén-részekkel rendelkeznek, mint a szóban forgó humán szöveti típusú plazminogén-aktivátorok. A jelen találmány továbbá az új humán szöveti típusú plazminogén-aktivátorok készítéséhez használatos rekombináns vektorokra, tenyészetekre és módszerekre is irányul. Egy ilyen humán szöveti típusú plazminogén aktívátor-ekvivalens a találmány oltalmi körén belül magában foglal egy úgynevezett egyedi-lánc mutánst, ahol a 275. és 276. aminosavak közti hasítási hely el van roncsolva, a proteolitikus enzimek által felismert aminosav-szekvencia eltávolításával. A szekvencia eltávolítást fajlagos aminosavak megváltoztatásával hajtjuk végre, pl. a később bemutatandó DNS kodonok hely-specifikus mutagenezisével. Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat. Az 1. ábra a kezeletlen (1. vonal) és 117. aminosav (Asn) csoportnál levő nagy mannóztartalmú szénhidrát-funkciós csoportok lehasítására képes endoglikozidáz H enzimmel kezelt (2. vonal) humán szöveti plazminogén aktivátor Coomassie-vel festett SDS-PAGE (nótrium-dodecil-szulfét-poliakrilamid-gél-elektroforézis) képét mutatja be. A nagymolekulájú esik a t-PA 1. lánc; a további fő csikók a Kringlel típus (KI), Kringlell típus (KII) és proteáz (P). A 2. ábra a redukált, karboxi-metilezett L-PA glükozidázos emésztését mutatja be. 1. vonal: -N-glikanáz; 2. vonal: +N-glikanáz; 3. vonal: -Endo H; 4. vonal: +Endo H. A csikók azonosításával kapcsolatban lásd az 1. ábrát. A 3. ábra a pUCPAaHD kiindulási plaz■nid restrikciós térképét mutatja be. A 4. ábra a triklórecetsavval (TCA) kicsapható radioaktivitás változását mutatja be az idő függvényében a kontroll humán szöveti típusú plazminogén-aktivátornál (□); olyan humán szöveti típusú plazminogén-aktivátornál, amelyet Endo H-folyamaton vittünk végig, de enzim nélkül (a); és Endo H-val kezelt humán szöveti típusú plazminogén aktivátornál (0). Az adatok átlagban vannak megadva tSD (standard deviáció; n = 5). Az 5. ábra a triklórecetsavval (TCA) kicsapható radioaktivitás változásának időbeli lefolyását mutatja be kontroll humán t-PA-nál (O) és glutaminnr-t-PA-nál (0). A 6. ábra a triklórecetsavval (TCA) kicsapható radioaktivitás változásának időbeli lefolyását mutatja be kontroll humán t-PA-nál (0) és glutamimiT-glutaminsav275-t-PA-nál (0). A továbbiakban részletesen leírjuk a találmány szerinti eljárást. A. Általános ismeretek Úgy találjuk, hogy a szénhidrát-szerkezet a 117. aminosavnól a következő összeállítású: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 4
