202276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új humán szöveti típusú plazminogén aktivátor polipeptidek előállítására
1 HU 202276 B 2 A jelen találmány új humán szöveti tipusú plazminogén aktivá torok kai foglalkozik, amelyek azzal jellemezhetők, hogy a 117, aminosav-gyöknél nem tartalmaznak szénhidrát-szerkezetű funkciós csoportot. Ezek az új humán szöveti tipusú plazminogén aktivátorok egyébként nem módosítottak a természetes állapothoz viszonyítva a 1B4. és/vagy 448. aminosav-gyököknél levő szénhidrátszerkezetű . funkciós csoportokat illetően. Meglepő módon ezek az új humán szöveti tipusú plazminogén aktivátorok megőrzik lényegében teljes biológiai aktivitásukat a természetes (nativ) anyaggal összehasonlítva, ugyanakkor váratlanul megnövekedett in vivo félélcttartammal rendelkeznek. A humán szöveti tipusú aktivátorok a plazminogént átalakítják plazminná. Az igy előállított plazmin proteolitikusan hasítja a fibrin-szerkezetet, amely a vérrógök alapját szolgáltatja. A humán szöveti tipusú plazminnogén aktivátor ennek megfelelően közreműködik a vérrögök feloldásában, következésképpen hasznos a különböző trombolitikus rendellenességek kezelésében. A t-PA rövidítést a humán szöveti típusú plazminogén aktivátorra egy benyújtott javaslatra a XXVIII. Nemzetközi Trombózis és Hemosztázis Találkozón (XXVIII. Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostasis), (Bergamo, Olaszország, 1982. július 27.) fogadták el. Ahogyan itt használjuk, a .humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor’, .t-PA’, .humán t-PA* vagy .humán plazminogén aktivátor* humán külső (szöveti tipusú) plazminogén aktivátort jelent, amelyet pl. természetes források extrakciójavai és tisztításával [lásd Collen és munkatársai: Európa szabadalmi bejelentés, 41 766 bejelentési szám (közrebocsátva 1981. december 16-án, az 1980. június 11—i első bejelentési időpontra visszahivatkozva); és Rijken és munkatársai: Journal of Bioi. Chem. 256, 7035 (1981), ezek az irodalmi helyek referenciaként vannak beépítve ebbe a bejelentésbe], vagy rekombináns sejttenyészet rendszerekben lehet előállítani, amint ez a t-PA aminosav-szekvenciájával, valamint fizikai és biológiai jellemzőivel együtt le van írva pl. a 93 619. bejelentési számú Európa szabadalmi bejelentésben (közrebocsátva 1983. november 9-én, az 1982. május 5-i első bejelentési időpontra visszahivatkozva); ez az irodalmi hely is referenciaként van beépítve a jelen bejelentésbe. A 4 326 033 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás beszámol az urokináz félélettartamának meghosszabitásáról szénhidrát-szerkezetének módosításával. Az urokináz immunológiailag eltérő a humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor-1 tói. Nincs igazolva sem a 4 326 033 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, sem másutt az, hogy az urokináznak ilyen Bzénhidrát-módositása alkalmazást nyert volna más glükoproteineknél. Mig a sziálsav eltávolítása a ceruloplazminból drámai módon csökkenti ennek félélettartamát, addig a transzferrin, egy másik szérum glikoprotein, azonos kezelésének nincs szignifikáns hatása a félélettartamra [Sharon: Complex Carbohydrates; Addison-Wesley Publ. Co. kiadása, 194-196 oldal (1975); Ashwell és munkatársai: Adv. Enzymology 41, 99 (1974); Alexander és munkatársai: Science 226, 1328 (1984)]. A WO 84/01786 közzétételi számú 1984. május HKén közzétett PCT szabadalmi bejelentésben, amely az 1982. október 28-án először benyújtott bejelentésen alapul, leírják szövet-típusú plazminogén aktivátor általános módosítását, amely a molekula csökkent biológiai aktivitását és bizonyítottan megnövekedett félélettartamát eredményezi, a nem módosított polipeptiddel összehasonlítva. Az egyetlen példa részlegesen tisztított humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor kezelését foglalja magában nátrium-perjodáttal, olyan terméket kapva, amely a beszámoló szerint az eredeti (módosítás nélküli) aktivitás mintegy 70-90%-ával rendelkezik. A WO 84/01786 számon közzétett anyagban nincs jele a természetes anyagban jelen levő szénhidrátszerkezet természete és jellege értékelésének. Valójában a perjodátról ismert, hogy oxidációval módosítja vagy szétroncsolja az összes szénhidrát-szerkezetet anélkül, hogy ezzel együtt jelentős mértékben távolitana el aminosav-kötéseket. Annak sincs jele a WO 84/01786 számon közzétett anyagban, hány ilyen szerkezetű humán szöveti tipusú aktivátorról van szó, vagy milyen a tényleges szénhidrát-összeállitás akár a módosítatlan, akár a módosított változatban, igy a perjodáttal kezelt molekulát legvalószínűbben megkülönböztetés nélkül oxidálva az összes szénhidrogén szerkezet módosul, tehát anélkül, hogy egy adott helyre összpontosulna az oxidáció. Nemrégiben arról számoltak be, hogy a glikozilált és deglikozilált humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor in vivo kiválasztódási sebességei nem különböznek szignifikánsan, azt a következtetést alakítva ki, hogy a humán szöveti típusú plazminogén aktivátor kiválasztódási sebességére a szénhidrátok távolléte nem hat [Larsen és munkatársai Proteases in Biological Control and Biotechnology, UCLA Symposium, Park City, Utah, 1986. február 9-14; Little és munkatársai: Biochemistry, 23, 6191 (1984)]. Arra a felfedezésre jutottunk, hogy a humán szöveti tipusú plazminogén aktivátornak speciális szénhidrát-szerkezete van a 117. aminosav-gyöknél, amely jelentősen különbözik a 184. és 448. aminosavgyököknél levő szénhidrát-szerkezetektől, és amikor ezt teljes mértékben (vagy az Asn aminosavhoz kapcsolt N-acetil-glükóz-amint kivéve) eltávolítják, új humán szöveti tipusú plazminogén aktivátor jön létre, amely megőrzi lénye-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
