202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
12 HU 202275 A -val a módszereknél ismertetett módon. A szűröket 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 2x SSC oldatban mossuk 42 °C-on, és Kodak XR5 filmen exponáljuk. A 28S és a 18S riboszoinális RNS-ek helyzetét nyíl jelzi mindegyik lemezen. A lambda 114 9,4 kb értékű BamllI töredékét, amely az A exont tartalmazza (lásd a 4. ábrát), a pESVDA BglII helyére klónozzuk (lásd a G. ábrát). A pESVDAlll.6 plazmid olyan irányítottsággal beillesztve tartalmazta a töredéket, hogy az SV40 korai promotor a megfelelő irányban Írja át a genomikus töredéket. A pESVDA111.7 az ellenkező irányítottságú, 9,4 kb értékű Bam töredéket tartalmazza. A pESVDA.S127 plazmid a lambda 114 12,7 kb nagyságú SacI töredékét tartalmazza, amely (tompa végű összekapcsolással) ugyanolyan irányítottsággal lett beillesztve a pESVDA BglII helyére, mint a pESVDA111.6 plazmid. A. lemez: pESVDA-vei, pESVDA111.7-tel és pESVDA111.6-tal átfertózött sejtekből származó teljes citoplazma RNS-t tartalmazó szűrök hibridizációja. A pESVD RNS (1. oszlop), pESVDA111.7 (2. oszlop), pESVDAlll.6 (3-5. oszlop). 8. faktor A exont tartalmazó töredékkel (1-4. oszlop) vagy 1800 bázispárból álló Stul/Bam töredékkel (5. oszlop) átvizsgálva. Gyenge kereszt-hibridizáció tapasztalható a 18S RNS esetén. B. lemez: RNS hibridizációja StuI/BamHI vizsgáiómintával (.intron vizsgálóminta' )• A következőkből származó RNS: 1) pESVDA, poliA-; 2) pESVDA, poliA*; 3) pESVDA111.7 poliA-; 4) pESVDAU1.7, poliA*; 5) pESVDAlll.6, poliA'; 6) pESVDA111.6, poliA*;. Az A5, Bl, B3 és B5 oszlopban látható kis sötét hibridizáló sáv valószínűleg a tRNS-val vagy az ebben a tartományban található Alu ismétlődő szekvenciával történő hibridizálást jelenti. C. lemez: A pESVDAlll.6 plazmidból (1. oszlop) és a pESVDA.S127 plazmidból (2. oszlop) származó A exont tartalmazó töredékkel átvizsgált citoplazma RNS összehasonlítása. Megfigyelhető a kis mértékű méretnövekedés a 2. oszlopban, amely a nagyobb genomikus töredékben lévő további exon szekvenciának felel meg. A 8. ábrán a pESVDA.S127 S36 cDNS klón szekvenciája látható. A pESVDA.S127 exonkifejezö plazmidból nyert S36 cDNS kiónhoz tartozó humán DNS betét DNS szekvenciája látható. (A részleteket lásd később). A 4. ábrán alkalmazottal hasonló módon látjuk el betűjelzésekkel a függőleges vonalakkal jelölt exonhatárokat, a Vili. faktor és az exonok genomikus cDNS kiónjainak analízise alapján. Megjelöljük a kiválasztott restrikciós endonukleáz helyeket. A 9. ábra a cDNS klónozását mutatja be. A Vili. faktor mRNS-t a harmadik sorban lévő üres téglalap szemlélteti, a rovátkolt 11 8 résszel és a mellette levő vonalakkal együtt. Maga a fehéren hagyott téglalap az érett fehérjét kódoló tartománynak, a rovátkolt rész a jelpeptidet kódoló szakasznak, a kétoldalt 5 lévő vonal pedig az üzenet lefordítatlan szakaszainak felel meg. Az mRNS 5’ vége bal oldalon helyezkedik el. Az mRNS sora felett a lambda 222 genomikus klón B exon tartományának kiterjedése látható, alatta pedig az ]0 mRNS vonalak azt a hat cDNS kiónt jelentik, amelyekből a VIII. faktor teljes hosszúságú kiónja felépül (a részleteket lásd később a leírásban). Az 1., 3. és 4. cDNS szintézis primerek, valamint az oligo(dT) nyilakkal van 15 megjelölve, jelezve annak a szintézisnek az irányát, amelyet beindítanak. Az ábra kiválasztott restrikciós endonukleáz helyeket és kilobázis egységekkel ellátott méretskálát is tartalmaz. 20 A 10. ábra a VIII. humán faktor génjének szekvenciáját mutatja be. Az összetett VIII. faktor cDNS klón teljes nukleotid szekvenciája látható, ahol a nukleotidok mindegyik sor bal oldalán számozva vannak. Az 25 ATG fordításbeindíló kódon A nukleotidja az 1. számú. A negativ számok az 5’ lefordítatlan szekvenciára vonatkoznak. (Az mRNS feltérképezésére irányuló kísérletek azt mutatják, hogy a VIII. faktor mRNS közelítőleg 60 30 nukleotiddal nyúlik túl 5’ felé, mint az ábrán feltüntetett -109 helyzet.) A megjósolt fehérjeszekvencia a DNS felett látható. Az aminosavak feletti számok a következők: Sl-19 a megjósolt jelpeptidre, 1-2332 pedig a 35 megjósolt érett fehérjére vonatkozik. .Op’ a TAG fordítás stop kódont jelzi. Az AATAAA 3’ poliadenilezési jel alá van húzva, és a poli(A) farok nyolc maradéka is látható, amely a lambda cl0.3 kiónban található. A 8.3 40 szintetikus oligonukleotid vizsgáló mintával homológ szekvenciát is aláhúzzuk (5557-5592. számú nukleotidok). A kiválasztott restrikciós endonukleáz hasítási helyeket a megfelelő szekvencia felett tüntetjük fel. A 2671-217. 45 számú nukleotidok genomikus klánokból származó szekvenciát képviselnek, a többi pedig cDNS szekvenciának felel meg. A VIII. humán faktor gén fehérje-kódoló tartományának teljes DNS szekvenciáját is meg- 50 határozzuk a leírt genomikus klónokból. Mindössze két nukleotid tér el a cDNS klónokból származó és ezen az ábrán bemutatott szekvenciától (kivéve a 2671-3217. nukleotidokat). a 3780. számú nukleotid (amelyet alá- 55 húztunk) G a cDNS kiónban, s aszparaginsavról glutaminsavra változtatja meg a 1241. számú aminosav kodont. A 8728. számú nukleotid (amelyet aláhúztunk) a 3’ lefordítatlan tartományban A a genomikus kiónban. 60 A 11. ábra a teljes hosszúságú rekombináns VIII. faktor plazmid összeállítását mutatja be. A teljes hosszúságú VIII. humán faktor cDNS-t tartalmazó pSVEFVIII plazmid felépítésével kapcsolatos részleteket a leírás 65 egy későbbi részében, a 8a. pontban ismer
