202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
13 HU 202275 A 11 tétjük. A leírásban és a 10. ábrán alkalmazott helyzetek számozása 72 bázispár értékkel tér el egymástól. A 12. ábrán a VIII. faktort kifejező plazmid összeállítása látható. A pAML3p.8cl plazmid összeállítását a leirás 8b. pontjában részletezzük. Ez a plazmid irányítja a működőképes VIII. humán faktor BHK sejtekben történő kifejezését. A 13. ábra a VIII. faktor Northern foltanalizisét mutatja be, fúziós fehérje antiszérumok alkalmazásával. A humán Vili. faktort 5-10% poliakrilamid grádiens nátrium-dodecil-szulfát gélen különitjük el a szakirodalomban ismertetett eljárással ILaemmli, Nature, 227, 680 (1970)]. A VIII. faktorra vonatkozó egyik oszlopot ezüsttel festjük meg [Morrissey, Anal. Biochem., 117, 307 (1981)]. A VIII. faktor többi oszlopát nitrocellulózra visszük át elektroforetikusan, Northern foltanalizis céljára. Radioaktiv izotóppal jelzett standard mintákat alkalmazunk a VIII. faktorral szomszédos oszlopokban, hogy meghatározzuk a megfigyelt sávok molekulatömegét. Amint jeleztük, a nitrocellulóz csikókat a megfelelő antiszérumokkal inkubáljuk, mossuk, majd 125I izotóppal jelzett A fehérjével vizsgáljuk át. A nitrocellulóz lapokat autoradiográfiának vetjük alá. A 14. ábrán fúziós fehérjék analízisét mutatjuk be C8 monoklonális antitest alkalmazásával. Az 1., 3. és 4. számú fúziós fehérjét Northern foltanalizissel vizsgáljuk, hogy meghatározzuk a reakcióképességüket a VIII. faktorra specifikus C8 monoklonális antitesttel. A 15. ábrán a VIII. faktor nagynyomású folyakékkromatográfiájának (HPU) elúciós görbéje látható, Toya Soda TSK 4000 SW oszlopon. Az oszlopon az egyensúly kialakítását és a kifejlesztést szobahőmérsékleten végezzük, 0,1% nátrium-dodecil-szulfátol tartalmazó 0,1 M nátrium-foszfát-oldat alkalmazásával (pH=7,0). A 16. ábra a VIII. faktor triptikus peptidjeinek fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás elválasztására vonatkozó elúciós görbét mutatja be. Az elválasztást Synchropak RP-P C-18 oszlopon végezzük (az oszlop méretei: 0,46 cm x 25 cm, 10 mikron). Az elúcióhoz acetonitril gradienst használunk, amelynek a koncentrációját 200 perc alatt 1%-ról 70%-ra növeljük. Az acetonitril 0,1%-os trifluor-ecetsavban van jelen. A nyíl azt a csúcsot jelzi, amely az AWAYFSDVDLEK szekvenciájú pepiidnek felel meg. A 17. ábra a tisztított VIII. faktor aktivitásának trombinnal történő aktiválását mutatja be. A sejt felülúszó folyadékot a C8 monoklonális gyantán kromatografáljuk, és dialízisnek vetjük alá az elúcióhoz alkalmazott puffer eltávolítására. Zérus időpontban 25 ng trombint adunk hozzá. Alikvot részeket hígítunk a jelzett időpontokban 1:3 arányban, és meghatározzuk a véralvadást előidéző aktivitást. Az egjség/ml dimenziójú értékeket a normális emberi vérplazma segítségévei felállított standard görbéről számítjuk ki. Az ábrák ismertetésénél számmal hivatkozott irodulmi helyek: (49j) Gingeras és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 13475 (1982); (49n) Simonson és munkatársai: Mol. Cell. Bioi. 3, 2250 (1983); A találmányt az alábbiakban részletesen ismertetjük. A. A leírásban alkalmazott definíciók A .humán VIII. faktor' kifejezésen olyan működőképes fehérjét értünk, amely képes in vivo vagy in vitro a humán VIII. faktor hiányának korrigálására, ilyen hiány például az A. hemofilia. A fehérjével és annak aktivitásával kapcsolatban a VIIIC faktor (FVII1C) és Vili. faktor alvasztó antigén (FVIIICAg) kifejezéseket is használjuk [Zimmermann és munkatársai, Haemostasis and Thrombosis, szerkesztő Bloom és Thomas, Churchill, Livingstone, 111. oldal (1981)]. A fenti Vili. faktort rekombináns sejttenyészetben állítjuk elő aktiv aiak(ok)ban, az emberi vérplazmában lévő, nativ Vili. faktor aktivitásának megfelelően. (Egy egység humán Vili. faktor aktivitás definíció szerint az az aktivitás, amely az Egészségügyi Világszervezet által standardként elfogadott humán vérplazma minta 1 milliliterjében fennáll.) A találmány szerint előállított Vili. faktor fehérjét a meghatározott DNS gén- és aminosav-szekvenciával, fizikai jellemzőkkel és biológiai aktivitással definiáljuk. A VIII. faktornak több lebomlási vagy feldolgozott alakja van természetes állapotban. Ezek proteolitikusan képződnek egy elövegyületból, amely egy láncból álló fehérje, amint azt a későbbiek során bemutatjuk. A találmány ilyen egyetlen láncból álló fehérjéket ismertet és bemutatja ezek előállítását önmagában, vagy a különböző lebomlási termékek egy szülővegyületének in vitro feldolgozásával. Ezeket a különféle lebomlási termékeket, amelyekről kimutattuk, hogy szintén rendelkeznek aktivitással, felhasználhatjuk a vérzékenység kezelésére. Ezek a termékek működőképesen aktiv részt/részeket tartalmaznak, amelyek natív anyagnak felelnek meg. Valószínűleg léteznek alléi változatok. Ezeknél a változatoknál egy vagy több aminosav eltérő lehet a teljes szekvenciától, vagyis egy vagy több aminosavra kiterjedő törlés, beillesztés, vagy inverzió lehet a teljes szekvenciában. Ezen túlmenően, a glikozilezödés helye és mértéke függhet a gazdasejt környezetétől. Annak a lehetősége is fennáll a rekombináns DNS technológia különféle humán VIII. fakLor származékok előállítására történő fehasználásánál, hogy különféle módosítások lépnek fel egy vagy több 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
