202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
9 HU 202275 A 10 ban hibridizálunk: 6xSSC, 50 mM nátrium-foszfát (pH=6,8), 5x Denhardt-oldat, 0,1 g/1 forralt, ultrahanggal kezelt lazacsperma DNS és 20% formamid. A hibridizálást 42 °C-on végezzük a módszereknél leírtak szerint. A hérom foltot lxSCC-t és 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó oldatban mossuk a lemez felett feltüntetett hőmérsékleten. Az egyes lemezek egyes oszlopai a következő feltárt töredékekre vonatkoznak: 1. számú oszlop - EcoRl IX; 2. számú oszlop - EcoRl 4X; 3. számú oszlop - Bamlll IX; 4. számú oszlop - BamHl 4X; M. jelzésű oszlop - a végén jelzett, lambdaHindllI és HaelII-vel emésztett $X174 marker töredékek. Az ábra jobb oldalán egy nitrocellulóz szűrő látható a 8.3. vizsgáló mintával hibridizált lambda/4X könyvtár átvizsgálásából. A nyilak két független, a Vili. faktorra pozitív kiónt jeleznek. A könyvtár átvizsgálása és mosása úgy történik, mint fentebb a Southern-foltképzésnél leírtuk, s a mosást 37 °C-on végezve. A 4. ábra a humán VIII. faktor génjének térképét mutatja be. Az ábra felső sorában a VIII. faktor génben lévő 26 fehérjekódoló tartomány (A-Z exonok) helyzetét és viszonylagos hosszúságát jelezzük. Az átirás iránya balról jobbra van. A második sorban a térkép méretaránya látható kilobázispár (kb) egységekben. A Vili. faktor gén térképezéséhez használt 10 restrikciós enzim felismerési helyeinek elhelyezkedését az ezt kővető vonalsorok mutatják be a 4. ábrán. Az üres téglalapok azoknak a humán genomikus [ez alatt a továbbiakban genomiális értendő) DNS-eknek a kiterjedését mutatják, amelyek az egyes lambda fág (lambda 114, lambda 120, lambda 222, lambda 482, lambda 599 és lambda 605) és kozmid (p541, p542, p543, p612, p613, p624) kiónokban jelen vannak. Az ábra alsó sora a genomikus átvizsgálásokhoz használt és a leírásban imertetett vizsgálóminták elhelyezkedését mutatja: 1) 0,9 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredék a p543-ból; 2) 2,4 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredék a lambda 222 fágból; 3) 1,0 kb nagyságú Ndel/BamHI töredéktriplett a lambda 120-ból; 4) 8.3 oligonukleotid vizsgálóminta; 5) 2,5 kb nagyságú StuI/EcoRI töredék a lambda 114 fágból; 6) 1,1 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredék a lambda 482 fágból; 7) 1,1 kb nagyságú BamHI/EcoRI töredék a p542-böl. A 46,XY és 49,XXXXY genomikus DNS Southern folt analízise nem tár fel észrevehető különbségeket a VIII. faktor génjének felépítésében. Az 5. ábra a pGcos 4 kozmid vektort szemlélteti. A pGcosl plazmid kialakításához a lambda C 1857S7 (Bethesda Research Láb.) 403 bázispárból álló összeforrasztott Hindi töredékét, amely a cos helyet tartalmazza, klónozzuk a pBR322 Aval és PvuII közötti részére. Az mp33dhfr plazmid előállítása céljából a pBR322 AhalII helyre klónozzuk a pFR400 (49n) 1624 bázispárból álló, PvuII és Nael közötti töredékét, amely egy SV 40 origót és promoLort, egy mutáns dihidrofolát reduktáz gént és hepatitisz B felületi antigén terminációs szekvenciát tartalmaz. Háromrészes ligálást és klónozást végzünk a pGcosl 1497 bázispárból álló Sphl és Ndel közötti töredéke, az mp33dhfr 3163 bázispárból álló Ndel és EcoRV közötti töredéke, valamint a pKT19 376 bázispárból álló EcoRV és Sphl közötti töredéke között, és ilyen módon létrehozzuk a pGco63 kozmid vektort. A pKT19 a pBR322 olyan származéka, amelyben a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító génben levő BamHl hely nitroguanozinos kezeléssel mutálva van. A pGcos4 kialakítására a pGcos3 EcoRl helyébe klónozunk egy szintetikus 20-raert terméket: 5’ AATTCGATCGGATCCGATCG. A 6. ábra a pESVDA térképét mutatja be. Korábban már leírták az SV40 vírus 342 bázispárból álló, PvuII HindlII közötti töredékét, amely átfogja az SV40 replikációs origót, és az EcoRl helyekhez való kapcsolással módosított [Crowley és munkatársai, Mol. Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]; a hepatitisz B (HBV) felületi antigén (49n) poliadenilezési helyét, amely egy 580 bázispárból álló, BamHl és Bglll közötti töredéken helyezkedik el; valamint a pBR322 plazmid pML származékát [Lusky és munkatársai, Nature, 293, 79 (1981)]. Az SV40 korai proraotorát követő EcoRl hely és a HBV BamHl helye közé illesztjük a PvuII-HindlII töredéket (az ábrán az adenovirus 2, 16,63-17,06 koordinátákkal), amely az első késői vezető donor összefonódási helyét (helyzete 16,65) tartalmazza, s ezt közvetlenül az adenovirus 2 840 bázispárból álló HindlII-SacI töredéke (helyzete 7,67-9,97) követi, (49 j), amely az Elb akceptor összefonódási helyet tartalmazza 9,83 értékű helyzetnél. A donor és az akceptor helyek kozott helyezkedik el egy egyedi Bglll és a HindlII hely a genomikus DNS töredékek beillesztéséhez. A 7. ábra a pESVDA vektorból történő ribonukleinsav átirások analízisét mutatja be. Összefolyó COS-7 sejteket tartalmazó, 10 cm átmérőjű lemezeket [Gluzman, Cell, 23, 175 (1981) átfertőzünk 2 pg plazmid DNS-val, a módosított DEAE-dextrán módszer [Sompayrac és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 7575 (1981)] alkalmazásával a következő szakirodalmi helyen leírt módon [Crowley és munkatársai, Mol. Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]. Az átfertózés után 4 nappal ribonukleinsavat készítünk a citoplazma kivonatokból (49n), és eleklroforézisnek vetjük aló denaturáló formaldehid-agaróz géleken. Nitrocellulóz szűrőkre visszük át, és az utóbbiakat hibridizáljuk a megfelelő 32P izotóppal jelzett DNS-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
