202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására

HU 202275 A 8

A találmány foglalkozik a lényegében tiszta, funkcionális humán VIII. faktorral is.

A találmány értelmében megfelelő, genetikailag manipulált gazdasejtek segítségével álli- Lurik elő emberi VIII. faktort a gyógyászat- 5 ban alkalmazható mennyiségben és tisztaságban. Emellett a találmány szerint termelt VIII. faktor mentes azoktól a szennyező anyagoktól, amelyek a nem-rekombináns sejtkörnyezetben általában kísérik. 10

A találmány foglalkozik továbbá olyan dezoxiribonukleinsav (DNS) izolátumokkal és DNS kifejező hordozókkal, amelyek a humán VIII. faktort kifejezhető formában kódoló génszekvenciákat tartalmaznak, valamint 15 olyan transzformáns gazdasejt-tenyészetekkel, amelyek a fentieket tartalmazzák, és képesek a működőképes emberi VIII. faktor termelésére.

Mindazok az eljárások is a találmány 20 tárgyát képezik, amelyekkel előállíthatok a fenti DNS-izolátumok, DNS kifejező hordozók és gazdasejt-tenyészetek. E sejttenyészetek fermentációs tenyészeteinek előállítására szolgáló eljárás is a találmány tárgyát képe- 25 zi.

Továbbá a találmány olyan új polipeptideket biztosít, amelyek az emberi VIII. faktor működőképes szegmenseinek megfelelő rószt/részeket tartalmaznak. Ezek az új poli- 30 peptidek alkothatják a természetes eredetű VIII. faktor biológiailag aktív és/vagy antigén determináns szegmenseit. Például a találmány szerinti polipeptidek alkalmasak vérzékenységben szenvedők kezelésére, különösen 35 olyan betegek esetén, akik a VIII. faktort semlegesítő antitesteket fejlesztenek ki a vérben. Ez utóbbi esetben, ha a betegeket a megfelelő antigén determinánsokat hordozó polipeptidekkel kezeljük, hatékonyan megköt- 40 hetjük ezeket az antitesteket, növelve ezáltal a humán VIII. faktor biológiailag aktív részeit hordozó polipeptidekkel történő kezelés hatásfokát.

A találmány szerint előállított VIII. fák- 45 tor DNS izolátumok, amelyek a humán VIII. faktor funkcionális részeit kódolják, alkalmazhatók a génterápiában, mivel helyreállítják a VIII. faktor aktivitását az ezt nélkülöző betegekben az ilyenfajta DNS beépítésé- 50 vei, például vérképző nyélsejtek útján.

Előnyösen a humán VIII. faktort funkcionális alakban állítjuk elő egy különösen alkalmas gazdasejt rendszerben. Ez a rendszer újszülött hörcsög-vesesejteket [BHK-21 55 (C—13), ATCC No. CCL 10] tartalmaz, amelyeket átfertőztünk a humán VIII. faktort kódoló DNS-t tartalmazó kifejező vektorral. (Ez magába foglalja a 3’- és 5’- lefordítatlan DNS-részt, és a 3'- lefordítatlan rész össze 60 van kapcsolva a 3’- lefordítatlan terminátor DNS-szekvenciával, amely például a hepatitisz B felületi antigénből származik.) A gén kifejezését átírási és átforditási szabályozó elemek segítik elő, amelyek közt találhatók az 65

adenovirus főbb késői promotora az 5’ illeszkedő vezetőjével, továbbá olyan elemek, amelyek SV40 replikációs origó tartományból származnak, pl. átirásfokozó és promotorszekvenciák. Emellett a kifejező vektor tartalmazhat egy D11FR gént is, amelyet egy SV40 kezdeti promotor működet - ez génerósitési képességet biztosit -, továbbá egy szelektálható marker gént, például a neomicinnel szembeni rezisztenciát biztosító gént. Ez utóbbit úgy vihetjük be, hogy együttes átfertőzést végzünk egy másik vektorral, amely a neomicinnal szembeni rezisztencia lehetőségét hordozza.

Az 1. ábra a véralvadási reakciósor vázlatát muttja be. (Davie és munkatársai, Ann. Rev. Biochem., 44, 799 (1975)].

A 2. ábrán a DNS olvadása látható TMAC1 és 6x SSC jelenlétében.

2A. ábra: Minden egyes feltüntetett ponthoz a lambda DNS tíz párhuzamos alikvot mintáját először nitrocellulóz szűrőkhöz kapcsoljuk. Ezeket a szűrőket ezután forraamid nélkül hibridizáljuk 37 °C-on a módszerek ismertetésénél leírtak szerint. A foltpárokat ezután 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 6xSSC oldattal (u) vagy a következő összetételű oldattal mossuk: 3,0 M TMAC1, 50 mM trisz-hidroklorid, pH=8, 0,1% nátriura-dodecil-szulfát és 2 mM etilén-diamín-tetraecetsav (O). Eközben mindig 2 °C értékkel növeljük a hőmérsékletet 38 °C-tól 56 °C-ig. Az olvadási hőmérséklet az a pont, ahol a hibridizációs intenzitás 50%-a megmarad.

2B. ábra: Az olvadási hőmérsékletet hasonló módon határozzuk meg, mint a 2A. ábránál, azonban pBR322 DNS alikvot mintáit kapcsoljuk a nitrocellulóz szűrőkhöz. Különféle hosszúságú töredékeket készítünk oly módon, hogy a pBR322 plazmidot Mspl-vel emésztjük, a töredékek végét 32P izotóppal megjelöljük, és poliakrilamid gélen elkülönítjük. A 18 és 75 bázispár közötti töredékeket formamid nélkül hibridizáljuk 37 °C-on, a módszerek ismertetésénél leírtak szerint. A szűrőket az alábbi összetételű oldattal mossuk: 3,0 M tetrametil-ammónium-klorid

(TMAC1), 50 mM trisz-hidroklorid, pH=8,0, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát és 2 mM etilén-diamin-tetraecetsav. Eközben a hőmérsékletet mindig 3 °C értékkel növeljük, hogy meghatározzuk az olvadási hőmérsékletet.

Az ábrán karikával jelzett pont a pBR322 plazmid Mspl vizsgáló töredékeire meghatározott olvadási hőmérséklet. A háromszöggel jelzett pont a 11 és 17 bázispár közötti mintákra vonatkozó, a 2A. ábráról átvett olvadási hőmérséklet 3,0 M tetrametil-ammónium-klorid alkalmazása esetén.

A 3. ábra a Vili. faktor génjének kimutatását szemlélteti a 8.3. vizsgáló minta segítségével. Az ábra bal oldalán lévő három lemez: 46,XY (IX, him) DNS és 49, XXXXY (4X) emberi DNS foltokat, amelyek EcoRI-gyel és BamHl-gyel emésztettünk, a következő oldat-6