202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
HU 202275 A 6 mennyiségekben all rendelkezésre, emellett az anyag instabil. A szakirodalomban beszámoltak azokról az erófeszitésekról, amelyek különböző tisztaságú Vili. faktor fehérjék elkülönítésére irányultak, temészetes eredetű, emberi és állati forrásokból [Vehar és munkatársai, Biochemistry, 19, 401 (1980); Fulcher és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 79, 1648 (1982); Fulcher és munkatársai, Blood, 61, 807 (1983); Fulcher és munkatársai, Blood, 63, 486 (1984); Fass és munkatársai, Blood, 59, 594 (1982); Knutson és munkatársai, Blood, 59, 615 (1982); Fay és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 79, 7200 (1982); Tuddenham és munkatársai, Symposium on Factor Vlll/von Willebrand Factor, October 7-9, 1982, p.l.J. Tekintettel a fentebb említett nehézségekre, fennáll az a lehetőség, hogy a megcélzott VIII. faktor fehérje helyett tévedésből egy, a VIII. faktort tartalmazó készítményben lévő szennyező fehérjét azonosítunk, majd klónozunk és termelünk. Ennek a lehetőségnek a valóságos voltát alátámasztja a von Vvillebrand-fehérje előbb említett téves azonosítása véralvadást okozó VIII. faktor fehérjeként. A VIII. faktoréhoz hasonló aktivitás azonosításánál jelentkező tévedés szintén határozott lehetőség. Akár a Xa. faktor, akár a trombin lerövidíti az alvadási időt a különböző vérplazmáknál, beleértve a VIII. faktorban hiányos vérplazmát is, és ennek következtében úgy tűnik, hogy a VIII. faktorhoz hasonló aktivitást mutat, hacsak megfelelő ellenőrzéseket nem végzünk. Bizonyos sejtekről szintén ismert, hogy olyan aktivitást hoznak létre, amely nagyon hasonló módon hathat, mint a várt Vili. faktor [Gordon és munkatársai, Thrombosis Res., 6, 127 (1975); Sacharski és munkatársai, Mayo Clinic Proc., 44, 784 (1969); Green és munkatársai, Blood, 37, 47 (1971)). Az utóbbi irodalmi hely azt támasztja aló, hogy ez a Vili. faktorszerű aktivitás ténylegesen egy szöveti faktornak nevezett fehérjének tulajdonítható. Ugyanezt az anyagot vagy hasonló anyagot az emberi méhlepényből is elkülönítettek tisztítással [Schwinn és munkatársai, 4 067 964 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirásj. Ez a fehérje, a vérplazma VII. faktor fehérjével együtt ugyanannál a lépésnél játszik szerepet, mint a Vili. faktor és a IXa. faktor, s a X. faktornak a Xa. faktorrá történő aktiválását eredményezi. Ezért a rekombináns VIII. faktor kifejezésénél először annak bizonyítása szükséges, hogy vajon kétségtelenül a VIII. faktornak megfelelő aktivitású anyag kifejeződése történik meg. A korábbi kutatóknak azt is meg kellett mutatniuk, hogy egy teljes vagy részleges kiónhoz jutottak, amely az egész Vili. faktort vagy annak egy részét kódolja, azonban az átlagos szakember számára meg5 oldhatatlan műszaki feladatot jelenthetett egy olyan rekombináns fehérje kifejezése, amely négyszer olyan nagy, mint bármelyik más, napjainkig kifejezett rekombináns fehérje. A fentiekben ismertetett nehézségekből következik, hogy alapos vizsgálatnak kell alávetni minden olyan bejelentést, amely szerint eredménnyel járt a humán VIII. faktor klónozása és kifejezése. A jelen találmánnyal elért eredményt az alábbi tények támasztják alá: 1) A klón eredetű VIII. faktor fehérjék elleni antitestek immunológiai kereszt-reaktivitása a vérplazma eredetű VIII. faktor fehérjékkel. 2) Az emberi vérplazmában lévő VIII. faktor elleni semlegesítő monoklonális antitestek keresztreakciója a kiónnal kódolt fehérjével. 3) Egy olyan genomikus DNS azonosítása, amely megfelel az X kromoszómában elhelyezkedő VIII. faktor cDNS-nek. (Ismeretes, hogy a VIII. faktor génjének kódolása az X kromoszómában történik). 4) Olyan funkcionális fehérje kifejezése, amely az alábbiakat mutatja. a) A VIII. faktor-hiányos vérplazma helyreállítása. b) Az X. faktor aktiválása Xa. faktorrá IXa. faktor, kalcium és foszfolipid jelenlétében. c) A fenti a) és b) pont szerint megfigyelt aktivitás inaktiválása a VIII. faktorra specifikus antitestekkel. d) Az aktivitás hozzákapcsolhatósága egy olyan immobilizált, monoklonális antitest oszlophoz, amely specifikus a VIII. faktorra. e) A VIII. faktor aktiválása trombinnal. f) A Vili. faktor kötődése immobilizólt von Willebrand-faktorhoz, és eluálhatósága erről. A találmány azon alapul, hogy eredménnyel járt a rekombináns DNS technológia alkalmazása működőképes humán VIII. faktor termelésére, olyan mennyiségekben, amelyek elegendők az azonosításhoz, a működőképesség alátámasztásához, továbbá állatkísérletek és klinikai kipróbálások lefolytatásához, hiszen ez utóbbiak a piaci bevezetés előfeltételeit képezik. A találmány szerint előállított humán VIII. faktor valamennyi működőképes alakjában alkalmas olyan emberek megelőző és gyógyító kezelésére, akiknél nem kielégítő a VIII. faktor véralvadásra gyakorolt hatása. Ennek megfelelően a találmány részben a klasszikus vérzékenység (vagy A hemofilia) embereknél történő kimutatására és a VIII. faktor alkalmazásával történő kezelésére, továbbá a VIII. faktort tartalmazó alkalmas gyógyászati készítményekre irányul. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
