202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
31 HU 302275 A 32 N. Vizsgálatok a VIII. faktornak az A.~ -hemofiliás plazma helyreállítását biztosító aktivitásának kimutatására A vizsgálat elmélete A VIII. faktor aktivitása definíció szerint az az aktivitás, amely korrigálja a Vili. faktorban hiányos vérplazma véralvadási hibáját. A VIII. faktor aktivitásának 1 egysége az az aktivitás, amely 1 milliliter normális emberi vérplazmában jelen van. A vizsgálat annak az időnek a megfigyelésén alapul, amely egy látható fibrinrőg képződéséhez szükséges A. vérzékenységben (klasszikus hemofiliában) szenvedő betegtől származó vérplazmában. Ennél a vizsgálatnál minél rövidebb idő szükséges a vérrög képződéséhez, annál nagyobb a VIII. faktor aktivitása a vizsgált mintában. Ezt a vizsgálattípust aktivált részleges tromboplasztin időnek (APTT) nevezzük. Az ilyen vizsgálatokhoz a reagensek a kereskedelemből beszerezhetők (például General Diagnostics Platelin Plus Activator, termékszám 35503). A vizsgálat kivitelezése Mindegyik véralvadási vizsgálatot 10 x x 75 mm méretű, boroszilikát üvegből készült kémcsövekben vitelezünk ki. A kémcsöveket szilikonnal vonjuk be, 1-10-szeresre hígított SurfaSil (a Pierce Chemical Company, Rockford, II. terméke) alkalmazásával, ahol a hígítást petroléterrel végezzük. A kémcsöveket megtöltjük ezzel az oldattal, 15 másodpercig inkubáljuk, majd az oldatot eltávolítjuk. A kémcsöveket háromszor mossuk csapvízzel, háromszor pedig desztillált vízzel. Piatelin Plus Activator készítményt (gyártó: General Diagnostics, Morris Plains, NJ) 2,5 ml desztillált vízben oldunk a csomagoláson feltüntetett útmutatás szerint. Ahhoz, hogy mintát készítsünk a véralvadási vizsgálatokhoz, a Piatelin Plus Activator oldatát 37 °C-ori 10 percig inkubáljuk, majd felhasználásig jégen tároljuk. Egy szilikonnal bevont kémcsőbe 50 mikroliter Piatelin Plus Activatort és 50 mikroliter, VIII. faktorban hiányos vérplazmát (George King Biomedical Inc., Overland Park, KA) mérünk. Ezt az oldatot összesen 9 percig inkubáljuk 37 °C-on. Közvetlenül a 9 perces inkubálási idő vége előtt a vizsgálandó mintát 0,02% szarvasmarha szérum albumint tartalmazó 0,05 M trisz-hidroklorid-oldattal (pll=7,3) hígítjuk. A vérplazma (aktivátor szuszpenzióhoz 50 mikroliter mennyiséget adunk a hígított mintából, és pontosan amikor letelt a szuszpenzió inkubálásának kilencedik perce, a véralvadási reakciósort 50 mikz-oliter 0,033 M kalcium-klorid-oldat hozzáadásával beindítjuk. A reakcióelegyet gyorsan összekeverjük, és a kémcsövet enyhén rázogalva megfigyeljük azt az időt, amely egy látható fibrinrőg képződéséhez szükséges. Standard görbét vehetünk fel a VIII. faktor aktivitásáról, ha a közönséges vérplazmát (George King Biomedical, Inc., Overland Park, KA) 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 és 1:200 arányban hígítjuk. A vérrögképzódési időt féllogaritmusos beosztású papíron ábrázoljuk a vérplazma hígításának függvényében. A kapott görbét ezután felhasználhatjuk ahhoz, hogy a vérrögképződés idejét a VIII. faktor aktivitásának egységeivé alakítsuk át. O. Meghatározás kromogén pepiiddel A meghatározás elmélete A Vili. faktor szerepet játszik a X. faktor Xa. faktorrá történő aktiválásában, IXa. faktor, foszfolipid és kalciumionok jelenlétében. Igen specifikus vizsgálatot dolgoztunk ki, amelynél a IXa. faktort, a X. faktort, a foszfolipidet és a kaciumionokat alkalmazunk. Ezért ennél a vizsgálatnál a Xa. faktor képződése a VIII. faktor aktivitású forrás adagolásától függ. Minél több VIII. faktort adunk a vizsgálathoz, annál több Xa. faktor képződik. Miután kialakult a Xa. faktor, kromogén peptid szubsztrátumot adunk a reakcióelegyhez. Ezt a pepiidet specifikusan hasítja a Xa. faktor, nem befolyásolja azonban a X. faktor, és csak lassan hasítják más pro- Leázok. A peptid elhasitásakor para-nitro-anilid-csoport szabadul fel, amelynek abszorbanciája 405 nm, míg a nem hasított peptid szubsztrátum csak csekély mértékű vagy semmilyen abszorbanciát nem mutat ezen a hullámhosszúságon. A kromogén szubsztrátum elhasítása folytán létrejövő abszorbancia kialakulása függ a reakcióelegyben az inkubálás után jelenlevő Xa. faktor mennyiségétől, amely viszont a reakcióelegyhez adott vizsgált mintában lévő működőképes VIII. faktor mennyiségétől függ. Ez a vizsgálat rendkívül specifikus a Vili. faktor aktivitására, és kevésbé van kitéve az esetleges hamis pozitív reagálásnak, mint a VIII. faktorban hiányos vérplazmával történő vizsgálat. A vizsgálat kivitelezése A Helena Laboratories, Beaumont, Texas cégtől szerezzük be VIII. faktort (Coatest Factor VIII, katalógusszáma 5293). Gyakorlatilag azt az eljárást alkalmazzuk, amelyet a gyártó javasol a .végpontot meghatározó módszerhez" olyan mintáknál, amelyek 5%-nél kevesebb VIII. faktort tartalmaznak. Ahol jelezzük, az inkubálási időt megnyújtjuk annak érdekében, hogy érzékenyebbé tegyük a vizsgálatot. Egyes vizsgálatoknál megváltoztatjuk a reagensek gyártó által javasolt térfogatát. Ez a módosítás azonban nem zavarja a vizsgálati eredményt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
