202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
33 HU 202275 A 34 A Xa. faktorhoz használt kromogén alapanyagot (S-2222 + 1-2581) 10 ml vízben oldjuk. Így 2,7 millimól) liter alapanyag-koncentrációt kapunk. Az alapanyagnak ezt az oldatát alikvot részekre osztjuk, és -20 °C-on fagyasztva tároljuk. A FIXa + FX reagens tartalmazza a IXa. és X. faktort, ezt 10 ml vízben oldjuk. Az oldatot alikvot részekre osztjuk, és a felhasználásig -70 °C-on megfagyasztva tároljuk. A reagenskészlet még a következő oldatokat tartalmazza: 0,025 mólos kalcium-klorid-oldat; foszfolipid (sertésagy) és puffer törzsoldat (Buffer Stock Solution). Ez utóbbi oldatból 1 részt 9 rész vízzel higitunk, Így a vizsgálathoz használt végső oldat 0,05 M trisz-hidrokloridot (pH=7,3) és 0,02% szarvasmarha albumint tartalmaz. Ezeket az oldatokat a felhasználásig 4 °C-on tároljuk. A foszfolipid + FIXa + FX reagenst úgy készítjük el, hogy 1 térfogatrész foszfolipidet 5 térfogatrész FIXa + FX reagenssel keverünk össze. Az alábbi eljárást alkalmazzuk: Reagens Minta Vakpróba Foszfolipid + + FIXa + FX 200 pl 200 pl Vizsgált minta 100 Pufferoldat - 100 Alaposan összekeverjük, és 37 °C-on 4 percig inkubálunk Kalcium-klorid 100 100 Alaposan összekeverjük, és 37 °C-on pontosan 10 percig inkubálunk S-2222 + 1-2581 200 200 Alaposan összekeverjük, és 37 °C-on pontosan 10 percig inkubálunk Ecetsav (50%-os) 100 100 Alaposan összekeverjük Meghatározzuk a minta abszorpcióját 405 nra-nél a reagens vakpróbával szemben spektrofotométer segítségével, 30 percen belül. A 405 nm-nél mért abszorbancia és a VIII. faktoraktivitás egységei közötti összefüggést kalibrálással határozzuk meg, amelyhez standard emberi vérplazmát (George King Biomedical, Overland Park, KS) használunk. A találmány egy előnyös kiviteli alakját az alábbi példán mutatjuk be. 1. A VIII. faktor gén előállításának általános stratégiája Rekombináns DNS gént a legáltalánosabban elfogadott eljárás szerint úgy állíthatunk elő, hogy a megfelelő szövet- vagy sejttípus mRNS-éból nyert cDNS kiónok könyvtárát átvizsgáljuk. Számos tényező járul hozzá ahhoz, hogy a VIII. faktor gén genomikus DNS-ének átvizsgálásához egy alternativ módszert is alkalmazzunk. Először is ismeretlen volt a VIII. faktor szintézisének a helye. Jóllehet, gyakran úgy vélik, hogy a szintézis legvalószínűbb helye a máj, a bizonyítékok nem meggyőzőek. A májban és esetleg a lépben lejátszódó szintézisre a szervótáramoltatásos és szervátültetési vizsgálatok mutatnak [Zimmerman és munkatársai, Haemostasis and Thrombosis, Bloom, A.L. és Duncan, P.T., Churchill Livinstone, New York, 111-123. oldal, 1981). Gyakran tapasztalható azonban a VIII. faktor nagyobb mértékű aktivitása olyan betegeknél, akik súlyos májbetegségben szenvednek [Meili és munkatársai, Thromb. Diathes. Haemorrh. 24, 161 (1970)]. A sejtekhez kötődő monoklonális antitestet alkalmazó, újabb, ellentmondásos vizsgálatoknál igen nagy koncentrációkban mutatták ki a fehérjét mind a máj szinuszoid andoteliális [Stel és munkatársai, Nature, 303, 530 (1983)], mind hepatocita [Kelly és munkatársai, Brit. J. Haem., (1984)], mind a nyirokcsomó sejtekben (a mennyiségek tekintetében utánuk a tüdő, a máj és a lép következik) [Exmer és munkatársai, Thrombosis ReB., 32, 427 (1983)]. Ugyanekkor a VIII. faktorral kapcsolatos antigént (von Willebrand-faktort) majdnem bizonyosan szintetizálják az endoteliális sejtek [Jaffe és munkatársai, J. Clin. Invest., 53, 36a (1974)]. Nemcsak a szöveti forrás bizonytalan, hanem a VIII. faktornak a vérplazmában lévő mennyisége is rendkívül csekély. A 100-200 ng/ml körüli áramló koncentráció (Zimmerman és munkatársai, Haemostasis and Thrombosis, 111-123. oldal) például a szérum albumin mólkoncentrációjának mintegy két milliomod része. Ezért nem volt nyilvánvaló, hogy egy adott szövetnek megfelelő RNS-ből készült cDNS könyvtárak a VIII. faktor kiónjait fogják eredményezni. A fenti megoldások alapján úgy döntöttünk, hogy először a lambda bakteriofágban lévő humán genom rekombináns könyvtárát vetjük alá szűrővizsgálatnak (a következőkben ezt genomikus könyvtárnak nevezzük). Jóllehet a genomikus könyvtáraknak tartalmazniuk kell a VIII. faktor génjét, intronok valószínű jelenléte akadályozhatja a rekombináns fehérje végső kifejezését. Stratégiánk általánosságban a következő volt: 1. Azonosítunk egy genom kiónt, amely megfelel a humán VIII. faktor fehérje egy maghatározott szekvenciájú részének. 2. .Genomikus sétát" (genomic walk) végzünk, hogy meghatározzuk az átfedő genomikus kiónokat, amelyek tartalmazzák a teljes mRNS kódoló tartományt. 3. A genomikus kiónok töredékeit felhasználjuk azonosításra a VIII. faktor mRNS szövet vagy sejt forrásaiban levő RNS-hez történő hibridizációval, majd ezekből a sejtekből cDNS kiónokat készítünk. 4. A fenti 3. ponttal párhuzamosan genomikus kiónok részeit fejezzük ki SV40 rekombináns .exonkifejezó" plazmidokban. Az ezekből a plazmidokból a szövettenyészet 19 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
