202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
29 HU 202275 A 30 cpm/oD, és 6-8 őrén ét inkubálunk. A bemélyedéseket ismét mossuk, és a radioaktivitást mérjük. A standard görbét közönséges vérplazma 1:10 és 1:320 közötti higítású mintáinak mérése alapján állítjuk fel. K. Vili. faktor monoklonális antitest oszlop Humán Vili. faktor monoklonális antitest oszlopot készítünk el úgy, hogy 1,0 mg C8 antitestet (0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban, pH=8,5) 1,0 ml Affi-Gel 10 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) jelenlétében 4 órán át inkubálunk 4 °C-on. Az antitestnek több, mint 95%-a a gélhez kapcsolódik, amint azt a Bio-Rad fehérjevizsgélat (Bio-Rad Laboratories) jelzi. A gélt 50 térfogat vízzel és 10 térfogat 0,05 M imidazollal (p!!=6,9), amely 0,15 M nátriuin-kloridot tartalmaz, mossuk. L. Táptalajok kromatografálása a monoklonális oszlopon A táptalajokat a monoklonális antitest oszlopra visszük fel, amely 1 ml gyantát tartalmaz. Az oszlopot 0,05 M imidazol pufferoldattal (pH=6,4) - amely 0,15 M nátrium-kloridot is tartalmaz - mossuk mindaddig, amíg a 280 nm-nél abszorpciót mutató anyagot ki nem mostuk. Az oszlopot ezután 1,0 M kálium—jodidot és 20% etilénglikolt tartalmazó 0,05 M imidazol pufferoldattal (pH=6,4) eluáljuk. A mintákat a vizsgálathoz felhígítjuk, és dialízisnek vetjük alá őket a későbbi analízishez. M. A VIII. faktor fúziós fehérjéknek és a fúziós fehérje antiszérumoknak az előállítása A fúziós fehérje kifejezésére kialakított plazmidokat tartalmazó Escherichia coli törzset M-9 táptalajon növesztjük 37 °C-on. A fúziós fehérje kifejezését indolil-akrilsav hozzáadásával inkubáljuk. Az indolil-akrilsav végső koncentrációját 50 Mg/ml értékre állítjuk be, 2,5-4 óránként történő hozzáadással. A sejteket centrifugálással különitjük el, és felhasználásig fagyasztva tartjuk. A sejtüledéket a fúzióhoz 100 ml 20 mM nátrium-foszfát-oldatban (pH=7,2) szuszpendáljuk, amely 10 pg/m\ lizozimot és 1-1 pg/ml RNózt és DNázt tartalmaz. A szuszpenziót 30 percig kevertetjük szobahőmérsékleten, hogy alaposan diszpergáljuk a 6ejtüledéket. A szuszpenziót 4 percig ultrahanggal kezeljük (60%-os teljesitménnyel sugározzuk be). Az oldatot GSA rotorral ellátott Sorvall RC-2B centrifugában centrifugáljuk 8000/perc fordulatszámon. A kapott üledéket újraszuszpendáljuk 100 ml 0,02 M nátrium-foszfát-oldatban (pH=7,2), majd a szuszpenziót 300 ml 60%-os glicerinre rétegezzük. A mintát 4000/perc fordulatszámon centrifugáljuk 20 percig RC-3B centrifugával. A glicerinben két fázis különül el. Mind az üledék, mind pedig az alsó glicerines fázis a nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélen végzett analízisnél egyetlen fehérjesávot mutat, amelynek a molekulatömege a várt 25000 dal- Lon. Az üledéket 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,02 M nátrium-foszfát pufferoldaLban oldjuk. Az ismét szuszpendált üledéket és az alsó glicerines fázist 0,02 M ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal szemben (pll=8,0) dializáljuk a glicerin eltávolítására. Az oldatot liofilizáljuk és újból oldjuk 0,1% nótrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,01 M nátrium-foszfát pufferoldatban, majd a felhasználásig fagyasztva tartjuk. A fentiekben a 3. számú fúziós fehérje előállítását ismertettük. Az 1. és 4. számú fúziós fehérjénél a sejtüledéket 0,05 M trisz-oldatban (pH=7,2) szuszpendáljuk, amely 0,3 M nátrium-kloridot és 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmaz. Lizozimot adunk hozzá 10 Mg/ml koncentráció eléréséig, majd a mintákat 5 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. NP-40-t adunk hozzá 0,2% mennyiségben, és a szuszpenziót jégen inkubáljuk 30 percig. Nátrium-kloriddal 3M végső koncentrációt állítunk be, és 1 Mg/ml DNázt adunk hozzá. A szuszpenziót 5 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. A mintát centrifugáljuk, és a felülúszó folyadékot elöntjük. Az üledéket kevés vízben ismét szuszpendáljuk, és a szuszpenziót centrifugáljuk. A sejtüledéket olyan oldatokban oldjuk, amelyek 0,1-1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmaznak, és a tisztítást vagy preparativ nátrium-dodecilszulfátos poliakrilamid gél elektroforézissel, és fúziós fehérjének megfelelő sáv azt követő elektroelúciójával, vagy nagy nyomású folyadékkromatográfiával végezzük TSK 3000 oszlopon, amelyet előzetesen 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,1 M nátrium-foszfát-oldattal hozunk egyensúlyba. Nyúl antiszérumot oly módon állítunk elő, hogy új-zélandi fehér nyulakba Freund-féle teljes adjuvánsban szuszpendált fúziós fehérjemintát fecskendezünk (első injeciókét), mujd kéthetenként további befecskendezéseket végzünk, Freund-féle inkomplett adjuvánsban szuszpendált minta alkalmazásával. Hat hét elteltével szérumokat veszünk az állatoktól, és analízisnek vetjük alá a szérumokat Western-féle foltanalízissel, amelynél az emberi vérplazmából származó VIII. faktor fehérjékkel szembeni reakcióképességet vizsgáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 05 17
