202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
27 HU 202275 A 28 Ez a sejtpopuláció sokféle jellemzójű sejtből áll. Ahhoz, hogy olyan sejtekhez jussunk, amelyek a FVIII kifejező plazmid legnagyobb számú másolatával rendelkeznek, a sejteket ezután a DHFR fehérje egy inhibitorával inkubáljuk. H. Kezelés metotrexáltal A G418-nak ellenálló sejteket gátolja a metotrexát (MTX), a DHFR egy specifikus inhibitora, 50 nM-nál nagyobb koncentrációkban. A metotrexátnak szövettenyészetben szaporított sejtekre gyakorolt hatásával foglalkozó korábbi vizsgálatoknak megfelelően azokat a sejteket választjuk ki, amelyek rezisztensek metotrexáttal szemben, mivel az FVIII kifejező vektorban lévő DHFR génnek többszörös másolatát fejezik ki. Ennek eredményeként az FVlII-at kódoló szekvenciák kifejezésének növekedése figyelhető meg. Ha fokozatosan növeljük az MTX mennyiségét, ezzel befolyásoljuk a pAML3P.8cl plazmid sokszorozódását, növelve ezáltal a másolatszámot. A sokszorozás felső határa sok tényezőtől függ ugyan, azonban ilyen módon kiválaszthatók olyan sejtek, amelyek rezisztensek az MTX millimól nagyságú koncentrációval szemben, s a DHFR-t kifejező (s igy az FVIlI-at kifejező) plazmid másolatainak százait vagy ezreit tartalmazzák. A VIII. faktor kifejezéséhez a G418-cal szemben rezisztens BHK sejteket, amelyek pAML3P.8cl-gyel és pSVENeoBal6-tal történő átfertózés után képződtek, olyan táptalajokon inkubáljuk, amelyek 100 nm illetve 250 nm MTX-et tartalmaznak [Simonson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 2495 (1983)]. 7-10 nap elteltével a 250 nM MTX-szel szemben rezisztens sejteket megvizsgáljuk a Vili. faktor kifejezésére vonatkozólag, az aktivitás, a radioaktiv immun-vizsgálat és az mRNS Northern-féle analízise alapján. I. A Vili. faktor antitestjei Munkánk során sokféle, VIII. faktorral szembeni poliklonális antitestet használunk. A CC olyan poliklonális antitest, amely súlyos hemofiliás beteg vérplazmájából származik [Rotblat és munkatársai, Thromb. Rés., 21, 431 (1981)]. A C8 olyan semlegesítő monoklonális antitest, amely a VIII. faktor 210 kD nagyságú részéhez kötődik [Rotblat és munkatársai, J. Lab. Clin. Med., 101, 736 (1983)]. A CIO olyan monokionális antitest, amelynek a tulajdonságai hasonlítanak a C8 tulajdonságaihoz, és az elkülönitése lényegében a Rotblat és munkatársai utóbbi közleményében leírtak szerint történik. Egy kereskedelemben hozzáférhető, semlegesítő monokionális antitestet, amely a VIII. faktor 80 kD nagy- 16 ságú részéhez kötődik, a Synbiotic Corp. (San Diego, California) cégtől szereztük be, termékszámú 10001. A C7F7 olyan semlegesítő monokonális antitest, amely a Vili. faktor 80 kD nagyságú részéhez kötődik. Ezt az antitestet a következőképpen indukáljuk és tisztítjuk: Hathetes nőstény BALB/c egereket többször beoltunk körülbelül 10 Mg tisztított VIII. faktorral, majd az utolsó beoltás után X63- -Ag8.653 egér raielóma sejtekkel fuzionált lépsejtekkel oltjuk be az állatokat, három nap elteltével [Kearney és munkatársai, J. Immun., 123, 1548 (1979)]. A hibridizációt és a hibrid sejteket klónozó módszerekkel történő elkülönítését a már korábban leírtak szerint végezzük [Simonson és munkatársai, Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 80, 2495 (1983)]. A specifikus antitest-termelő kiónokat szilárd fázisú radioaktív immunvizsgálattal (RIA) mutatjuk ki [Benton és munkatársai, Virol., 117, 490 (1982)]. A pozitív kiónokat azután átvizsgáljuk a véralvadást megnyújtó képességre a fentebb leirt APTT vizsgálattal. A monokionális C7F7 antitestet szingenikus állatokban szaporítjuk. Az antitestet fehérje A-Sepharose CL-4B kromatográfiával tisztítjuk az ascites folyadékokból [Chalon és munkatársai, J. Immun., 9, 359 (1979)]. J. A VIII. faktor radioaktív immunvizsgálatai Két radioaktív immunvizsgálatot fejlesztettünk ki a BHK és más sejtvonalakból termelt VIII. faktor vizsgálatára. Mindkét módszer két szakaszból áll, ahol szilárd hordozóhoz kapcsolt CC antitestet használunk fel a VIII. faktor megkötésére [Rotblat és munkatársai, J. Láb. Clin. Med., 101, 736 (1983)]. Ezt az immunkomplexet azután I125 izotóppal jelzett CIO antitesttel (210 kD specifikus) vagy I125 izotóppal jelzett C7F7 antitesttel (80 kD specifikus) detektáljuk. Röviden, a két szakaszból álló radioaktiv immunvizsgálatokat a következőképpen vitelezzük ki. Egy mikrotitráló lemez 96 bemélyedését egy éjszakán át bevonjuk 100 pl 50 mM nátrium-hidrogén-karbonát pufferoldattal (pH= =9,6), amely 2,5 mg/1 CC antitestet tartalmaz. Ez utóbbit A-fehérje-szefaróz kromatográfiával tisztítottuk [Chalon és munkatársai, J. Immun, 9, 359 (1979)]. A bemélyedéseket háromszor mossuk 200 ul PBS-oldattal, amely 0,05% Tween 20-t tartalmaz, és 1-2 órán át blokkoljuk 0,1% zselatint és 0,01% mertiolátot tartalmazó 200 ul PBS-oldattal. A bemélyedéseket ismét mossuk az előzők szerint, hozzáadunk 100 pl mintát, és egy éjszakán át inkubáljuk. A bemélyedéseket mossuk a fentebb leírtak szerint, hozzáadunk 100 pl mennyiségű, I125 izotóppal jelzett [Greenwood és munkatársai, Biochem. J., 89, 114 (1963)] CIO vagy C7F7 antitestet (1000 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
