202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
25 HU 202275 A 26 kicsapással töményitjük a DNS-t, és a pAdHindB plazmid létrehozáséra a HindllI enzimmel hasított pUC13-ba klónozzuk INorrander és munkatársai, Gene, 26, 101 (1983)]. Ezt a Hindii! szubklónt emésztjük HindllI és Sáli enzimmel, és egy olyan töredéket különítünk el, amely a 17,1-25,9 koordináták közötti adenovirus résznek felelt meg iGingeras és munkatársai idézett publikációja]. Ezt a töredéket HindllI és Sáli enzimekkel hasított pUC13-ba klónozzuk, és igy a pUCHs plazmidot kapjuk. A pAdHindB plazmidból elkülönítjük a Sáli és Xhol közötti, 25,9-26,5 koordinátájú töredéket, és a pUCHS plazmidba, az egyetlen Sáli helyre klórozzuk. Ilyen módon a pUCHSX plazmidot hozzuk létre. Ez a plazmid helyreállítja az adenovirus szekvenciákat a 17,1 helyzettől kiindulva (első késői vezető közbeavatkozó szekvencián belül) a 26,5 helyzetű Xhol helyig (harmadik késői vezető exorion belül). Az adenovirus fő késői promotorét úgy klónozzuk, hogy az akrilamid gélből kimetszszük a HindllI C, D és E töredékeket (amelyek együtt vándorolnak), a pUC13-ba klónozzuk ezeket a HindllI helyre, és restrikciós analízissel átvizsgáljuk a HindllI C töredéket tartalmazó rekombinánsokat. Ezt a szubklónt SacI enzimmel emésztjük, amely 15,4 helyzetben, a fő késői promotortól 5’ felé [Gingeras és munkatársai idézett közleménye], valamint a pUC13 polilinkerben hasit. A DNS-t ismét kör alakúvá tesszük, és így a pMLP2-t kapjuk, amely a pUC13 SacI és HindllI helyébe klónozott SacI és HindllI közötti (15,4-17,1 helyzetű) töredéket tartalmazza. E. Neomicinnel szemben rezisztens vektor kialakítása Az Escherichia coli 5. transzpozonban lévő, neomicinnel szembeni rezisztenciát adó jelzőt (markert) egy Tn5-tartalmú plazmidból különítjük el [Picken és munkatársai, Inf. and Immun., 42, 269 (1983)]. A neomicinnel szembeni ellenállást biztositó gén szekvenciáját korábban már publikálták [Beck és munkatársai, Gene, 19, 327 (1982)]. A neo töredéket BglII enzimmel tárjuk fel, amely a neonácin foszfotranszferáz gén lefordítás-beindító kodonjától 5’ felé 36 bázispár távolságra elhelyezkedő ponton hasít, és Bal31 exonukleázzal kezeljük. A foszfotranszferáz gént BamHI enzimmel elmetsszük. Ez az enzim a leforditás-lezáró kodon után 342 bázispárral hasítja a DNS-t. Az így kapott részt beillesztjük a pBR322 plazmidba egy betöltött HindllI hely és a BamHI hely közé. Az egyik klón (pNeoBal6) tartalmazza a betöltött HindllI helytől 3’ felé 3 bázispár távolságra elhelyezkedő lefordítást beinditó kodont (TCATCGATAAGCTCGCATG...). Ezt a plazmidot Cial és BamHI enzimmel emésztjük, majd a foszfotranszferáz gént átfogó, 1145 bázispár nagyságú töredéket elkülönítjük, és beillesztjük a pCVSVEHBS emlős kifejező vektorba (lásd alább). Az igy kapott pSVENeoBal6 plazmid tartalmazza a foszfotranszferáz gént az SV40 korai promotortól 3’ felé, és a HBV felületi antigén gén poliadenilezési helyétől 5’ felé tartalmazza [Simonson és munkatársai, Mol. Cell. Bioi., 3, 2250 (1983)]. Ha ezt a plazmidot bevisszük emlős szóvettenyészet sejtjeibe, képes a foszfotranszferáz fén kifejezésére, és rezisztenciát biztosit a G418 aminoglikozid ellen [Southern és munkatársai, J. Mól. and Applied Gen., I, 327 (1982)]. F. Szövettenyészet sejtjeinak átfertózése A BHK-21 sejtek (ATCC) szövettenyészeten növesztett gerinces sejtek. Mint ismeretes, ezek a sejtek állandó sejtvonalként tarthatók fenn. E sejtvonalak az elkülönített közönséges sejtek egymást követő sorozatátvitelével állíthatók elő. Ezeket a sejtvonalakat vagy szilárd hordozón tartjuk fenn cseppfolyós táptalajon, vagy szilárd hordozó tápanyagokat tartalmazó szuszpenziókban növesztjük őket. A sejteket a kívánt vektor 5 Mg menynyiségével fertőzzük át (4 Mg pAML3P.8cl és 1 Mg pSVEneoBal6). A vektorokat a fentiek szerint állíthatjuk elő, ismert eljárás alapján [Graham és munkatársai, Virology, 52, 456 (1978)]. Az eljárás biztosítja egy plazmidgyűjtemény kölcsönhatását egy adott gazdasejttel, növelve ezáltal annak valószínűségét, hogy ha egy plazmidot abszorbeál egy sejt, további plazmidok is éppúgy abszorbeálódnak [Wigler és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 3567 (1980)]. Ennek megfelelően, mind az elsődleges, mind a másodlagos kódoló szekvenciákat különálló vektorok alkalmazásával külőn-külön célszerű bevinni, vagy egyetlen olyan vektort alkalmazunk, amely mindkét szekvenciát tartalmazza. G. Az átfertőzött sejtek növesztése és peptidek kifejezése A fentiek szerint átfertözésnek alávetett BHK sejteket először két napig növesztjük nem-szelektív táptalajon, majd a sejteket 400 Mg/ml G418 koncentrációjú táptalajra visszük át, ilyen módon kiválasztva azokat a sejteket, amelyek képesek a foszfotranszferáz plazmid kifejezésére. A G418 jelenlétében lefolytatott 7-10 napos növesztés után a telepek szabad szemmel is láthatókká válnak. A több száz telepet tripszinnel kezeljük és újabb lemezre szélesztjük ezeket, lehetővé téve a gyors növekedést összefolyásig egy 10 cm átmérőjű lemezen. Ilyen módon G418 rezisztens sejteket kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
