202273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Bf1I jelű új restrikciós endonukleáz előállítására Bacillus cereusból
3 HU 202273 B 4 37 °C-on 60 percig végezzük. A reakciót 3 pl reagenssel állítjuk le, ennek összetétele: 0,2 M EDTA, 50X szaccharóz, 0,1% bróm-fenolkók. Az elegyet 1,4%-os agaróz gélen elektroforetizéljuk. Az elektroforézis puffere 0,05 M Tris-acetát pH = 8,05, 0,02 M nétrium-acetát, 2 mM EDTA. 200 V, 2 óra. A DNS-t etidium-bromiddal festve detektáljuk [lásd: Biochemistry 12, 3055 (1973)]. Az enzimaktivitást mutató frakciókat egyesítjük és PC pufferral szemben dializáljuk. A következő tisztításnál PC pufferral ekvilibrált 3 x 25 cm-es Whatman DE52 DEAE-cellulóz oszlopot alkalmazunk, az elválasztás lineáris gradiens elúcióval történik, 1000 ml PC pufferban 0-0,5 M NaCl-ot adagolva. A 0,15-0,20 M NaCl-tartalom mellett eluált frakciókat gyűjtjük, ezeket egyesítve, a fenti módon PC pufferral szemben dializáljuk. Végül 1,5 x 15 cm-es Whatman P 11 foszfo-cellulóz oszlopon 200 ml PC pufferral választjuk el a 0,50-0,7 M NaCl-tartalom mellet eluélódó enzimaktiv fehérjéket, ezt tároló pufferral szemben dializáljuk. A nyert enzim hozama 50 egység/g nedves sejt. Jele: BflI. Az enzim nem igényel Na- vagy K-ionokat, Mg2* igénye kb. 3 mM, pH optimuma 7,8, hőoptimuma 37 °C. A példákban alkalmazott táptalajok és pufferok összetétele: YTA táptalaj: Bacto tripton 10 g, Bacto élesztőkivonat 5 g, NaCl 5 g, Bacto agar 15 g, csapviz ad 1 1. Sterilezés: 120 °C-on, 30 percig. YTB táptalaj: Bacto tripton Bacto élesztőkivonat NaCl csapvíz Sterilezés: 120 °C-on 30 percig. 10 g, 5 g, 5 g, ad 1 1. PC puffer: 0,01 M pH = 7,4 kálium-foszfát puffer, 0,1 mM EDTA, 0,01 M 2-merkapto-etanol. 2. példa A BflI enzim jellemzése 5 a) Felismeróhely igazolása Ismert módon elvégezzük pBR 322 plazmid kettős hasítását az új enzimmel, és vele, illetve mellette az alábbi ismert enzimekkel: 10 Bspl, Hpall, Alul, MboII, Avail, Sail, HindlII, BamHI, Ball, PstI, BglI, Foki. Az enzimek Biolabs illetve REANAL termékek. A nyert fragmentumok analízise azt mutatja, hogy az új enzim a pBR322 plazmidot három helyen ha- 15 sitja a 600-620, 1150-1170 és 2950-2980 bézispárok között. A fenti három szakaszon két homológ régió található: a CCTAA és az ACGGC szerkezet. Lambda bakteriofággal végzett hasonló vizsgálat a CCTAA felismerő- 20 helyet kizárja, és az ACGGC szerkezetet igazolja; minthogy ennek előfordulási gyakorisága arányos a kimutatható bontási fragmensek számával. Ez a felismerőhely II S tipusú enzimet jelent, egyben utal arra, hogy a hasi- 25 tóhely a felismerő szekvencián kívül van. b) A hasitóhely megállapítása Ebben a vizsgálatban pKLTl plazmidot, 30 vagy más, kis molekula tömegű DNS-t használtunk, melyből kihasítható volt a pKLTl plazmid HindlII-HinfI szakasza. A kívánt DNS fragmens bázissorendje az 1. ábra szerinti. A fragmenst 5’-végen jelöljük polinukleotid-ki- 35 názzal gamma-32P-ATP jelenlétében. [Az ismert módszer leírása: Maniatis Lab. Manual, Cold Spring Harbor Lab., N. Y. (1982)]. A preparátumokat a vizsgált enzimmel emésztjük az alábbi közegben: 1,01 M pH = 40 =7,8 Tris-HCl puffer, 0,003 M MgClz, 100 Mg/ /ml zselatin, 1 mL az 1. példa szerinti enzimoldatból, 1 Mg DNS fragmens; 50 m1 össztérfogat, 37 °C-on, 1 órán át inkubálva. Az emésztés sorén kb. 30 bázispár hosszú 45 HindlII-BflI fragmens keletkezik. Ezt Maxam-Gilbert módszerrel vizsgáljuk. [Methods Enzymol., 5, 499-560 (1980)]. A gélanalizis eredménye szerint a hasitóhely ACGGC(N)iz illetve TGCCG(N)i3 (lásd 2. ábra). 50 Tároló puffer: 0,05 M KCl 0,01 M pH = 7,5 Tris-HCl puffer 0,1 mM EDTA 55 1,0 mM ditio-treitol 200 Mg/ml marhaszérum albumin 50% glicerin. 60 65 3. példa Az 1. példa szerint előállított fermentléból a sejttömeget kinyerjük. 26 g nedves sejtanyaghoz 40 ml feltárópuffert (0,01 M 2- -merkapto-etanolt tartalmazó 0,01 M pH = 7,5 tris-HCl-t) adunk. Ultrahangos kezelést végzünk (50%-os munkaidő, 10 perc időtartam), a törmeléket centrifugálással eltávolítjuk (35 000 rpm, 60 perc). A felülúszóhoz (48 ml) 1,25 g KCl-ot és 3,36 ml 10%-os Polymin P-t (Serva, Heidelberg) adunk, az elegyet olvadó jég hőfokon 30 percig lassan keverjük, a keletkező csa4
