202273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Bf1I jelű új restrikciós endonukleáz előállítására Bacillus cereusból
5 HU 202273 B 6 padékot centrifugálással elválasztjuk (20 000 rpm, 20 perc). A nyers, fehérjetartartalmú oldatot 6 órán át dializáljuk. Az első tisztitólépésként Heparin-Sepharose kromatográfiát végzünk, 1,5 x 15 cm-es oszlopon, 30 ml/h fejlesztő sebességgel, eluensként 0,0-0,6 M NaCl-t tartalmazó PC puffert alkalmazva. Az aktív frakció 0,06-0,15 M NaCl-nál nyerhető. A továbbtisztitást 1,5 x 5,0 cm-es aminopentil kromatográfiás oszlopon végezzük, eluensként 0,0-0,6 M NaCl-os PC puffert alkalmazva. A gyűjtött frakciók 0,12-0,18 M NaCl értéknél vannak. Az oldatot, tárolópufferral szemben dializáljuk. A nyert preparátum aktivitása megfelel az 1. példa szerintinek. 4. példa Bacillus cereus subsp. fluorescens NCAIM B (P) 001018 számú törzset YTA agáron tenyésztjük. Háromnapos ferde agar tenyészetet lemosunk 5 ml AGK táptalajjal, majd a szuszpenzióval 300 ml AGK táptalajt oltunk 1 1-es Erlenmeyer lombikban. A tenyésztést 20 órán át 37 °C-on folytatjuk rázatással (rpm 350). A tenyészetet centrifugáljuk (8000 rpm, 30 perc), 24 g fuganedves sejttömeget nyerünk, ezt az 1. példa szerint dolgozzuk fel. A kapott enzim hasítási jellege szerint a BflI-el azonos. Ismert DNS molekulák emésztésének az eredményét mutatja be a 3. ábra. Az AGK táptalaj összetétele: aszparagin 1 g glükóz 5 g kukoricalekvár por 2 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,05 g magnézium-szulfát 0,01 g csapviz ad 1 1. SZABADALMI IGÉNYPONT Eljárás BflI jelű restrikciós endonukleáz előllitására, azzal jellemezve, hogy Bacillus 5 cereus subsp. fluorescens NCAIM B (P) 001018 törzset vagy annak a fenti enzimet termeld mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén-, nitrogénforrást és ásványi sót tartalmazó táptalajon süllyesztett, aerob kö- 10 rülmények között tenyésztünk, majd a sejttömegből kinyerjük a BflI enzimet. 15 20 25 30 35 40 Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4981 - KJK 91.3911.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató 5
