202273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Bf1I jelű új restrikciós endonukleáz előállítására Bacillus cereusból
1 HU 202273 B 2 A restrikciós endonukleózok azon enzimek, melyek a kettősláncú DNS-ben bizonyos, rájuk jellemző szekvenciákat felismernek, majd endonukleolitikusan mindkét láncot hasítják. Mai tudásunk szerint restrikciós endonukleázok csak prokariota szervezetekben, azaz baktériumokban és kékalgákban keletkeznek, itt viszont elég gyakoriak. Az eddig ismert restrikciós endonukleázok száma meghaladja a 400-at. Különböző eredetű és szerkezetű enzimek végezhetnek azonos funkciót, ezek az ún. izoszkizomer enzimek. A felismerési specificitás az enzimek nagy száma mellett is kevesebb mint 100-féle. Az enzimes bontások egyik csoportjánál a hasítás a két láncot szemben, azonos helyen vágja el, .tompa’ véget eredményezve. Egy másik típusú hasítás a két láncot aszimmetrikusan vágja el, igy 3’- vagy 5’- túlnyúló, .ragadós' vég keletkezik. A restrikciós endonukleázok felismerő szekvenciája gyakran ún. palindrom, azaz olyan DNS szakasz, amely leolvasás-szimmetrikus, az egyik szál bázissorendje a komplementer 6zál megfelelő darabján visszafelé olvasva azonos, CTGCAG pl.: GACGTC* A felismeróhely vagy hasítóhely változatainké bóvitése igen nagy jelentőségű. A restrikciós endonukleázok kutatási és gyakorlati alkalmazása ma már szélesen elterjedt és sokcélú. Valamennyi feladatban fontos, némely feladatban döntő ismérv, hogy ezen enzimek meghatározott helyen egy konkrét DNS szerkezetet definiálnak. A definiálható helyek és szerkezetek számának bővítése értelemszerűen bővíti az alkalmazás és válasznyerés lehetőségeit. A széleskörű alkalmazásból kiemelve néhányat:- DNS fizikai térképezése- DNS módosítása rekombináns DNS technikával (mutánsok előállítása, nemesítés)- DNS izolálása hibridizációs próbák segítségével- diagnózis DNS azonosítása alapján- diagnózis DNS mutáció igazolása alapján- faj, fajta, törzs azonosság, vagy eltérés igazolása DNS szerkezet alapján- magasabbrendű szervezetben DNS metiláltság helyének megállapítása a hasithatóság alapján stb. A restrikciós endonukleázok egy érdekes alcsoportja a II S enzimtípus. Ezek nem palindrom felismerő szekvenciához kapcsolódva a felisraeröhelyen kívül hasítanak, természetesen szintén specifikusan (Gene 47, 1-154, 1986). Kutatásaink sorén sikerült egy olyan baktériumtörzset izolálnunk, melynek tenyészetéből egy eddig nem ismert specificitású II S típusú enzim nyerhető. A törzs Bacillus cereus subsp. fluorescens, melyet az Ipari és Mezőgazdasági Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében NCAIM B (P) 001018 számon deponáltunk. A találmány szerint előállított BflI enzimet vizsgálatoknak vetettük alá, a felismerőhely és hasitóhely megállapítására. Úgy találtuk, hogy az enzim felismeröhelye: ACGGC (N)i2 TGCCG (N)i3* (a felismeróhelytöl 12 ill. 13 nukleotidnél történik a hasítás) A találmány szerint a BflI enzim előállítására úgy járunk el, hogy Bacillus cereus subsp. fluoreszcens NCAIM B (P) 001018 törzset asszimilálható szén-, nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztünk, majd a sejttőmegböl a keletkezett enzimet kinyerjük. A találmány szerinti eljárást az alábbi példák kapcsán részletesen is ismertetjük. 1. példa Bacillus cereus subsp. fluorescens NCAIM (P) 001018 számú törzset YTA jelű agaron tartjuk fenn, 2-3 havonkénti átoltással, a 37 °C-on 16 óra alatt kinőtt ferde agar tenyészeteket jégszekrényben +4 °C-on tárolva. Az enzim előállításához ugyanezen táptalajból Petri-csészében lemezt öntünk, a törzset erre szélesztjük. A kinőtt telepek közül néhányat kaccsal levéve 10 ml YTB táptalajban szuszpendáljuk, és egy éjszakán át szaporítjuk. Az .overnight* szuszpenzióból 1 ml-rel rázólombikban 100 ml YTB táptalajt oltunk, ezt 6 órán át rázóasztalon (180 rpm) 37 °C-on inkubáljuk, és oltótenyészetként használjuk. A termelő fermentációhoz 1 1 YTB táptalajt sterilezünk 3 1-es Erlenmeyer lombikban, ezt 10 ml oltótenyészettel oljtuk be. A szaporítás rázóasztalon (180 rpm) 37 °C-on történik, 8 órán át. A fermentációt leállítva a fermentlevet centrifugáljuk (4000 rpm, 30 perc), 1 1 fermentléből 50 g fuganedves sejtet nyerünk. A sejteket kétszeres mennyiségű 0,01 M 2-merkapto—etanol-tartalmú, 0,01 M pH = 7,5.Tris-HCl pufferban szuszpendáljuk, a sejtek feltárását ultrahanggal, SONIFER CELL DISRUPTOR készülékkel 10 percig végezzük. A sejttörmeléket 60 perces ultracentrifugálással (35 000 rpm) tóvolitjuk el. A felülúszóhoz 1 M koncentrációig NaCl-ot adunk, és a sejtkivonatot 4 x 90 cm-es Bio-Gel A-0,5 m oszlopon kromatografáljuk. Az eluens 1 M NaCl, 0,01 M pH 7= 7,5 Tris-HCl, 0,01 M 2-merkapto-etanol-oldat. 6 ml-es frakciókat szedünk, ezekben restrikciós enzim-aktivitást vizsgálunk. Módja az alábbi: 0,01 M pH = 7,8 Tris-HCl, 3 mM MgCh, 6 mM 2-merkapto-etanol, 0,1 mg/ml zselatin közeghez 25 m1 végtérfogatban 1 pg lambda fág DNS-t és 2 pl mintát adunk. Az inkubálást 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
