202221. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amino-alkil-szubsztituált heterogyűrűs kénvegyületek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 202 221 B 8 szárítjuk, majd enyhe melegítéssel elpárologtatjuk. A Z/E alkoholkeverékct gyorskromatográfiával (szilikagél, etil-acclát 40%-os hexános oldata) választjuk el, így 72%-os kitermeléssel 20: 1 arányú izomer-keveréket kapunk. 0,2 g (1,5 mmól) Z-alkoholt 24 ml - 0,8 g (3,07 mmól) trifenil-foszfínt tartalmazó - tetrahidrofuránban és 6,45 ml 0,95M - 6,13 mmól hidrazinsavat tartalmazó - benzolos hidrazinsav-oldatban oldunk. Ehhez az oldathoz 0 *C-os hőmérsékleten, sötétben, cseppenként hozzáadunk 0,62 (3,07 mmól) diizopropil-azidokarboxilátot 2,4 ml tetrahidrofuránban oldva. Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet 0 ’C-on 45 percig keverjük, majd vízzel hígítjuk, és etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot sós vízzel hígítjuk, és etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot sós vízzel mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepároljuk. A terméket gyorskromatográfiával tisztítjuk (szilikagél, éter 3%-os pentános oldata) így 0,7 g (73%) elválaszthatatlan Z/E izomerkeveréket kapunk. AZ- és E-azidok keverékéből 1,15 g-ot (7,42 mmól) 16 ml éterben oldunk, és nitrogén-atmoszférában, -5 *C-on, sötétben, cseppenként hozzáadjuk 0,41 g (10,72 mmól) éteres lítium-alumínium-hidrid-szuszpenzióhoz. Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet -10 'C-on 30 percig keverjük, majd egymás után 0,41 ml víz, 0,41 ml 15%-os nátrium-hidroxid-oldat és 1,23 ml víz hozzáadásával a reakciót befagyasztjuk. A kapott szilárd anyagot diatómaföldön leszűrjük és éterrel mossuk. A szűrletet 25 'C-on bepárolva áttetsző olajat kapunk. A Z-amint gyorskromatográfiás úton (szilikagél, 20% metanol és 5% ammónium-hidroxid éterben oldva) választjuk el, a termék tozilátsóját pedig az étercs oldatból 1M etanolos pTSA-oldattal csapjuk ki, így 1,08 g (48%) fehér szilárd anyag alakjában a cím szerinti vegyület amin-sőját kapjuk; op.: 134-136 'C. Elemanalízis a CuH^NCV^ képlet alapján: számítolt: C: 51,80, H:6,35, N:4,65%; mért: C: 51,79, H:6,36, N:4,61%. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a dopamin-p-hidroxiláz (DBH) inhibitorai vagy más módon csökkentik a vérnyomást, ezért feltehetően értékes gyógyszerekként alkalmazhatók a magas vérnyomás kezelésében. Az emlősök magas vérnyomásának kezelésére szolgáló eljárás abból áll, hogy az emlősnek az (I) általános képletű vegyülctből vérnyomáscsökkentőként hatásos mennyiséget tartalmazó gyógyszerkészítmény t adunk be. Az alábbi eljárásokkal demonstrálható a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek használhatósága. Minthogy a DBH a norefinefrin (NE) szintézisében fontos szerepet játszó enzim, egy DBH-inhibitor jelenléte csökkenti a képződő norefinefrin mennyiségét, ezáltal vérnyomáscsökkentő hatást fejt ki. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek DBH-inhibcáló tulajdonságai hagyományos és jól ismert módszerekkel határozhatók meg. Ha például meghatározzuk a DBH- inhibiciót az idő függvényében, ez a DBH-inhibitor időbeli kinetikájának bemutatására szolgál. Példa erre az az eljárás, melynek során valamely szubsztrálnak DBH-val végzett enzimes oxidációját vizes oldatban, molekuláris oxigén, egy elektrondonor, például aszkorbát és az enzimhez szükséges kofaktorok jelenlétében, pH 4,5 és 5,5 között, előnyösen pH = 5,0-nél, 20 'C és 40 ”C közötti, előnyösen 37 'C hőmérsékleten határozzuk meg. A vizsgált vegyületet a kívánt koncentrációban alkalmazzuk, és a rendszert inkubáljuk. Különböző időközökben aliquot mintákat veszünk, és a DBH aktivitásának méréséhez szubsztrátként tiramint alkalmazunk. A reakciót az S. May és munkatársai által leírt [J. Bioi, Chem., 256,2258 (1981)] módszerrel követjük, az oxigénfelvétel mérésére polarográf elektródot és egy oxigénmonitort alkalmazunk. A fenti módon végzett vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy a vizsgált vegyületek DBH-inhibiciós aktivitása az inkubációs idő függvényében növekedett, amint az az I. táblázaton látható. I. táblázat DBH-inhibiciós aktivitás az idő fiiggvényében In vitro vizsgálat A tozilát-só 11/2 Vegyület koncentrációja +/- standard hiba 1. 100 M 5,5 perc +/- 0,54 2. 100 M 32,7 perc /-1,4 3. 100 M 48,1 perc +/-1.5 4. 100 M 35,6 perc+M,3 t 1/2: az az idő, ami ahhoz szükséges, hogy a maradó aktivitás 50%-ra csökkenjen. 1. vegyület: 2-(l,3-ditiolán-2-ilidén)-etán-amin 2. vegyület: 2-(l,3-ditiol-2-ilidén)-etán-amin 3. vegyüld: 2-(l,3-ditiolán-2-ilidén)-2-propán-amin 4. vegyüld: (E)-2-[dihidro-2(3H)lienilidén]-etán-amin. Az 1. táblázat adatai azt mutatják, hogy a vizsgált vegyületek közül a legaktívabb az 1. vegyület, ezt bizonyítja a rövid időtartam, ami a DBH inaktiválásához szükséges. A (Z)-2-[dihidro-2(3H)tieniüdén]-etán-amin az idő függvényében végzett vizsgálatban nem volt aktív, viszont in vivo körülmények között aktív vérnyomáscsökkentő, amint azt a későbbiekben ismertetjük. A találmány szerinti eljárással előállított vegyüldek in vitro is könnyen meghatározhatók olyan hagyományos és jól ismert módszerekkel, melyek a tiraminnak DBH jelenlétében oktopaminná történő átalakulását vizsgálják. Ilyen például az N. B. Feilchenfeld, H. W. Richter és W. H. Waddell által leírt eljárás [,,Time-Resolvcd Assay of Dopamine Beta Hydroxylaze Activity Utilizing High-Pressure Liquid Chromatography” (Dopamin-bcta-hidroxiláz aktivitásának vizsgálata az idő függvényében nagynyomású folyadékkromatográfiával) Analyt. Biochem., 122,124-128 (1982)]. A DHB- inhibició kinetikájának meghatározását például úgy végezzük, hogy meghatározzuk a tiraminnak enzim közreműködésével oktopaminná való átalakulását oly módon, hogy a vizsgált vegyületet állandó szubsztrát-koncentráció mellett, enzim (DBH), molekuláris oxigén és egy elektrondonor, például aszkorbát, valamint az enzimhez szükséges kofaktor jelenlétében optimális hőmérsékleten és pH-n inkubáljuk. Az inkubálás után a terméket nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával elválasztjuk és mennyiségét fluorometriásan meghatározzuk, ebből könnyen kiszámítható az inkubációs állandó (ki). Az l,3-ditiolán-2-etán-amint a fenti módon vizsgálva a krre 11 mikromólos értéket kaptunk, ami azt mutatja, hogy a vegyületnek jelentős a DBH-inhibeáló aktivitása. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
