202034. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új tetraploid és biszabololdús kamilla populációk előállítására
HU 202034 B 2 4-10 óra lehet. Csírák alkalmazása esetén a behatási időtartam adott esetekben 36 óráig is elnyúlhat. A kémiai anyaggal való kezelés után a megduzzadt magvakat, csírákat, illetve egyéb növényrészeket vízzel többször leöblítjük. A megduzzadt magvakat például elvezetjük. A kezelt gyökeres növényeket, egyéb növényrészeket vagy kezelt csírákat például ültető ládákba ültetjük. Az így kezelt magvakból, illetve csírákból létrejövő növényeket például melegházban, nappal 18-25 °C hőmérsékleten, éjjel pedig 10-16 °C hőmérsékleten tartjuk, és a növények tenyészidejének végén ezekből kiválasztjuk azokat a növényeket, amelyeknek pollentje mintegy 1,5-szer nagyobb a kiinduló növények pollentjeinél, illetve amelyeknél a szomatikus sejtek kromoszóma száma 36. Abban az esetben, ha egyéb növényi részeket (föld fölötti vagy föld alatti részeket) vetünk alá kémiai kezelésnek, akkor kizárólag kezelt részekből származó hajtásokat, gyökereket, virágokat vagy magvakat vetjük alá későbbi vizsgálatnak a bekövetkezett tetraploidizálásra vonatkozóan. Ha például sarjkezelést vagy levélhónalj kezelést végzünk, ezt követően csak e sarjból, illetve levélhónaljból létrejövő új hajtást és az ezen képződött virágokat, illetve magvakat vizsgáljuk kromoszóma szám szempontjából. A pollennagyság méréseket és a kromoszóma számlálásokat például úgy végezhetjük, mint a 3. példánál ismertetjük. A sugarakkal való tetraploidizálásnál például a magvakat vagy gyökércsúcsokat 0 és 35 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 10 és 30 *C közötti hőmérsékleten, főként 15 és 25 °C közötti hőmérsékleten kezeljük. A besugárzás nagysága 5-50 Krad. Előnyösen gamma vagy röntgen sugarakat alkalmazunk. Ultraibolya sugarakból például azokat használhatjuk előnyösen, amelyeknek hullámhossza 400-30 nm, főként 350 nm. Az így besugárzott növényeket, illetve növényrészeket ugyanúgy kezeljük tovább, mint a kémiai anyagokkal való kezelés után. Magas hőmérsékletek alkalmazása esetén például 33-50 °C közötti, előnyösen a 42 és 45 °C közötti hőmérsékletek használhatók. E hőmérsékleteknek például duzzadt magvakat, csírákat, hajtásokat és osztódásra képes szöveteket teszünk ki. A kezelés időtartama például 1-48 óra, előnyösen 12-24 óra lehet. Alacsony hőmérsékletekként 0-5 °C, előnyösen 0,5-4 °C, főként 2 °C hőmérsékletek alkalmazhatók. Ezeknek a hőmérsékleteknek például duzzadt magvakat, csírákat, hajtásokat és osztódásra képes szöveteket teszünk ka. A kezelés időtartama például 1-100 nap, előnyösen 20-40 nap. Az így kezelt növényeket, illetve növényrészeket ugyanúgy kezeljük tovább, mint kémiai anyagokkal való kezelés után. A lefejező-kallusz-eljárást például fiatal növényeken a száron, előnyösen a csúcs tenyésztőkúpon, a 4-6. levelek kialakulása után, vagy a levélszárakon vagy oldaljhajtásokon hajtjuk végre. A -sebzési szövetből (kalluszszövetből) létrejövő rügyeket, illetve hajtásokat levágjuk, meggyökereztetjük, edényekben továbbtermeszjük és a tetraploidizált növényeket a kémiai kezeléseknél alkalmazotthoz hasonló módon kiszelektáljuk. Portoktermesztés (növények létrehozása fél portokokból egyszerű kromoszómakészlettel és ezutáni. illetve ehhez csatlakozó spontán vagy mesterséges tetraploidizálással). Virágzó növényekről zárt csővirágokat aratunk, amelyeknek portokjai az első pollen indirekt sejtmagosztódás állapota előtt vannak. A bimbókat mikromanipulátor segítségével a portokokból kiemeljük és petricsészékbe helyezzük, amelyek például Nitcsh és Nitcsh tápanyaggal (1. táblázat) vannak töltve. Ezután a petricsészéket egy termesztő térben nappal 28 °C hőmérsékleten és éjjel 20 “C hőmérsékleten 16 óráig tartjuk. Körülbelül négy hét után kezdenek a portokok feltörni és a növénykék kinőni. Ezek diploid szülőfél esetén haploidok, és ha az egyik szülő tetraploid, akkor dihaploidok. Az új növényeket a gyökerek kialakulása után például kertiföldes edénybe helyezzük és melegházban virágzásig neveljük. Ezek a (di)haploid növények sterilek, azonban sarjcsúcs-, gyökér-, vagy szárkezelés révén kémiai anyagokkal, például kolhicinnal poliploidizálhatók, aminek eredményeként homozigót növények állnak elő, amelyek azután magvak révén tovább szaporíthatok. A további kezelés azonos a kémiai anyagokkal való kezeléssel, például a kolhicinnal való kezeléssel. 1. táblázat Nitcsh és Nitcsh tápanyag (Scinece, 1969) mg/1 kno3 950 NH4N03 720 MgS04x7H20 185 CaCb 166 KH2PO4 68 MnS04x4H20 25 H3BO3 10 ZnS04x7H20 10 Na2Mo04x2H20 0,25 CUS04X5H20 0,025 1000 ml-enként 7,45 g etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsó és 5,57 g FeS04x7H20 oldatából 5 ml mio-inozit 100 glicin 2 nikotinsav 5 piridoxin-HCl 0,5 tiamin-HCl 0,5 folsav 0,5 biotin 0,05 szacharóz 20 g kész táptalaj (DIFCO-BACTO-Agar) 8 g indol-ecetsav 0,1 Az anyag pH-ja 5,5-re van beállítva. A pollennagyság mérés és/vagy a kromoszómák számlálása révén kiszelektált kamilla tetraploid növényekből - amelyek az előzőekben ismertetett lehetőségekből nyerhetők - kiszelektáljuk azokat a növényeket, amelyeknek kamazulén tartalma legalább 100 mg % és biszabolol tartalma legalább 200 mg%, ugyanekkor a megmaradó biszaboloidok (főként a biszabololoxid) mennyisége 50 mg % alatt van (a szárított virágokra vonatkoztatva, 1. példa). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
