201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B 11 12 lyen parazita, illetve rovar ellen használjuk. Például antelmintikaként használva, a vegyületeket beadhatjuk szájon keresztül kapszula, bólusz, tabletta vagy folyadék alakjában, de bejuttathatjuk injekcióként vagy beültetéssel is. Ezeket a készítményeket az állatgyógyászatban általánosan alkalmazott, szokásos eljárásokkal állítjuk eló. A kapszulák, bóluszok és tabletták előállításánál a hatóanyagot finoman elporított hígító- vagy hordozóanyagokkal keverjük össze, a készítmény tartalmazhat még szétesést elősegítő anyagokat és/vagy kötőanyagokat, például keményítőt, laktózt, talkumot, magnéziumsztearátot stb. A folyékony orális készítmény a hatóanyagot vizes oldatban diszpergálva tartalmazza diszpergáló-, nedvesítőanyag stb. mellett. Az injektálható készítményt steril oldat alakjában készítjük el, mely más anyagokat is tartalmaz, például a vérrel izotóniát biztosító sókat vagy glükózt. A készítmények a hatóanyag mennyiségét illetően változhatnak. A hatóanyag alkalmazott mennyisége függ a kezelendő gazdaállat fajtájától, a fertőzés súlyosságától, a gazdaállat testsúlyától. Szájon át történő beadásnál a hatóanyag mennyisége általában 0,001-10 mg között változik testtömegkilogrammonként. Ezt a mennyiséget beadhatjuk egyszeri vagy elosztott dózisban. Általában 1-5 napos kezelésére van szükség. Természetes a megadott mennyiségek a találmány oltalmi körét nem korlátozzák, ennél kevesebb vagy több hatóanyagot is alkalmazhatunk. A vegyületeket beadhatjuk az állatok táplálékával is, e célból töményebb adalékkészítményt vagy premixet készítünk, melyet a szokásos állati táplálékokhoz keverhetünk. Inszekticidként és a mezőgazdasági káros rovarok elleni készítményként permet, hintőpor, emulzió, stb. alakjában alkalmasuk a vegyületeket, mely készítményeket a mezőgazdaságban szokásos eljárások szerint készítjük el. A S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzset az alábbi többlépéses eljáráson keresztül állíthatjuk elő: 1. lépés: S. avermitilis ATCC 31272 törzset növesztünk 30 °C hőmérsékleten 12 napon keresztül egybefüggő tenyészetté New Patch Agar táptalajon. A táptalaj összetétele: V-8 léx káldum-karbonát agar vízzel kiegészítve Nutrient broth nátrium-acetát-3-vízql,4 g/1 izovaleriánsav izovajsav ot-metil-vajsav izoleucin leucin valin nyomelemoldat3“ 200 ml 3g 15g 1000 ml-re 1,0 g/liter 50mg/l 50 mg/1 50mg/l 250 mg/1 250 mg/1 250 mg/1 lml/1 xNyolc növényi lé keveréke: paradicsom, sárgarépa, zeller, répa, petrezselyem, saláta, vízitorma és spenót, hozzáadva só, aszkorbinsav, citromsav és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 természetes aromásítóanyagok. (Campbell Soup Company, Camden, NJ, USA). «A nyomelemoldat összetétele: vas(III)-klorid-6-víz 2,7 g mangén(II)-szulfát-víz 4,2 g réz-szulfát-5-víz 0,5 g káldum-klorid 11,0 g bórsav 0,62 g kobalt-klorid-6-víz 0,24 g cink-klorid 0,68 g nátrium-molibdenát 0,24 g A felsorolt sók 1 liter 0,ln sósavban feloldva. Három lemezről spórákat gyűjtünk, és 20 ml 0,05 mólos trisz/maleinsav pufferben, pH = 9,0 szuszpendáljuk. 2. lépés: 10 ml spóraszuszpenziót hozzáadunk egy kémcsőben 10 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozóguanidinhez (NTG), és a csövet 28 #C hőmérsékleten rázatjuk 60 percen keresztül. Ezután a spórákat bőséges mennyiségű 1%-os nátrium-klorid-oldattal mossuk. 3. lépés: A mosott spórákat 1%-os nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót azonos térfogatú 80%-os etilén-glikollal keverjük össze. A szuszpenziót -20 °C hőmérsékleten tároljuk, és ezeket a sejteket használjuk a mutánsok keresésére. A szuszpenzió 1 milliliteréből kb. 104 telepet kapunk. A spórákat YPD lemezekre szélesztjük, lemezenként kb. .100 telepet kapva. Az YPD táptalaj literenként 10 g élesztőkivonatot, 10 g Bacto peptont, 10 g dextrózt és 15 g Bacto agart tartalmaz, az autoklávozás előtt pH=6,9 értékre beállítva (a Bacto készítmények a Difco Laboratories-ból származnak, Detroit, Michigan 48238, USA). 4. lépés: 2-3 hetes, 28 °C hőmérsékleten történő kinövesztés után különálló telepeket oltunk át a szabályos 96 lukú mikrotiter lemez egyes lukaiban. Ugyancsak átoltjuk a kérdéses telepeket friss agaros táptalajra is, hogy a mutánsok meghatározása után legyenek életerős sejtforrásaink. 5. lépés: minden egyes lukba bemérünk 75 mikroliter folyékony M9-es szintetikus tápközeget, mely 1% glükózt, 0,1% kazaminosavat, 0,01% izovaleriánsavat, 0,01% izovajsavat és 0,01% metilvajsavat is tartalmaz. Néhány napos 28 °C hőmérsékleten történő inkubálás után a sejteknél megvizsgáljuk az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitást. Az M9-es táptalaj egy litere 6 g dinátrium-hidrogén-foszfátot, 3 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g nátrium-kloridot és 1 g ammónium-kloridot tartalmaz. Autoklávozás után a fenti oldathoz hozzáadunk 1 ml steril 1M magnéziumszulfát oldatot és 1 ml 0,1M kálcium-kloridot. 6. lépés: 5% toluolt szuszpendálunk M9-es szintetikus táptalajban rövid ultrahangos kezeléssel. 25 ml ilyen szuszpenzióhoz hozzáadunk 1,2 ml [14C-l]-2-oxo-izokapronsav oldatot, melynek akti-7
