201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B vitása milliliterenként 2,5 mikrocurie és mikromólonként 10,0 mikrocurie. Ebből a keverékből 50 mikrolitert adunk a mikrotiter lemez minden egyes, a viszgálandó telepeket tartalmazó lukába. 7. lépés: Az egyes lukakból termelődő jelzett széndioxidot (14CC>2) megkötjük, és Tabor és munkatársai módszerével láthatóvá tesszük [J.Bacteriol., 128: 485-486 (1976), „Convenient method for detecting 14CC>2 in multiple samples: Application to rapid screening for mutants”]. Azok a mutánsok, melyek nem tartalmaznak elágazó láncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitást, csak annyi jelzett báriumkarbonátot eredményeznek, mint a kontrollok. Egy javított módszernél, mely növeli a 14CÜ2 teszt érzékenységét, a pozitív vizsgálatnál a jelzett bárium-karbonát keletkezésének eredményeként sötét folt jelenik meg az autoradiogrammon; negatív vizsgálatnál nincs folt vagy csak nagyon halvány. A fenti 4. lépésnél kapott különálló telepeket 2-3 hetes kinövesztés helyett 7-14 napos kinövesztés után kiemeljük az agarlemezről, és az 5. lépés kihagyásával közvetlenül vizsgáljuk a 6. és 7. lépésnél leírtak szerint. A felszabaduló jelzett széndioxid mennyiségi meghatározásán alapuló még tovább fejlesztett vizsgálati módszer a következő. A mutánsokat M9- es pufferolt közegben tenyésztjük, mely 1% glükózt és 0,1% „Syncasa-bcaa”-t tartalmaz. A „Syncasabcaa” a kereskedelmi kazaminosavak összetételével körülbelül megegyező szintetikus L-aminosav keverék, de nem tartalmaz L-valint, L-izoleucint, és L-leucint (1. alább). Miután a tenyészet nagy sejtsűrűséget ért el, a sejteket M9-es pufferolt közegben mossuk, és M9- es pufferben szuszpendáljuk fel, amely 1% toluolt is tartalmaz. Előzőleg a toluolt ultrahanggal diszpergáljuk, tejfehér szuszpenziót nyerve. A sejt/puffer/toluol szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 40 percen keresztül, hogy a sejtek permeábilisek legyenek. A permeabilizált sejteket M9-es pufferolt közegben mossuk, és az eredeti térfogat egy ötödében szuszpendáljuk ugyanebben a közegben. 180 mikroliter szuszpenziót használunk fel a vizsgálatokhoz. A 300 mikroliteres reakciókeverék tartalmazza a toluollal kezelt sejteket, 0,4 mM triamin-pirofoszfátot (TPP), 0,11 mM koenzim-A-t (CoA), 0,68 mM nikotinamid-adenin dinukleitidot (NAD), 2,6 mM ditiotreitolt (DTT), 4,1 mM magnézium-kloridot, 60 mM Trisz-CCl-t (pH = 7,5) és [14C-l]-2-oxo-izokapronátot, melynek aktivitása 6000 cpm, mikrocurie mikromólonként. A számlálási hatékonyság 73%-os. A reakciót egy 15 milliliteres szcintillációs csőben végezzük, melyben egy 2x2 cm-es Whatman 4-es papír négyzet van a zárókupakba szorítva. A papírba 30 mikroliter 1M Hyamine Hydroxide-ot (metil-benzetonin-hidroxid 1 mólos oldata metanolban; Sigma Chemical Co., St.Louis, MO. 63178, USA) szivatunk be, mely elnyeli a termelődő jelzett széndioxidot. 2 órás inkubáció után, a papírt 10 ml Beckman Aquasol II (New England Nuclear Research Product, Boston, MA 02118, USA) szcintillációs számlálási folyadékba merítjük, és 4 órás vagy 13 ennél hosszabb kiegyenlsúlyozódás után mérjük a rádioaktivitást folyadék szcintillációs számlálóban. A kontroll vak kísérlet - azaz ahol nincsenek sejtek jelen - kb. 50-300 cpm értéket ad. Az 1-3 mutánsok vagy az ehhez hasonlók a vak kontrolinál kisebb vagy azzal egyenértéket adnak, míg a szülőtörzs a vak érték többszörösét eredményezi. A „Syncasa-bccaa” készítmény százszoros tö-14 ménységű koncentrátum: g/1 L-alanin 3 L-ar ginin 4 L-aszpar ginsav 6 L-cisztin 1 L-glutamonsav 20 glicin 1 L-hisztidin 2 L-lizin 7 L-metionin 3 L-fenil-alanin 6 L-prolin 10 L-szerin 6 L-treonin 4 L-tirozin 4 L-triptofán 1 Az oldat kémhatását pH=7 értékre állítjuk be, és szűréssel sterilizáljuk. 1 rész koncentrátumot adunk 99 rész közeghez, hogy a szokásosan használt koncentrációkat beállítsuk. Az elágazó láncú 2-oxo-sav-dehidrogenáz és az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitásokkal nem rendelkező, kétszeresen blokkolt mutánst [S.avermitilis 7881 (ATCC 53692) törzs] az alábbi lépéseken keresztül állítjuk elő. 1. lépés: S.avermitilis ATCC 53567 törzset összefüggő tenyészetté növesztünk New Patch Agar Medium-on tenyésztve 12 napon át 30 °C hőmérsékleten. Három lemezről összegyűjtjük a spórákat, és 20 ml 0,05M trisz/maleinsav pufferben, pH=9,0 szuszpendáljuk. 2. lépés: 10 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozóguanidint (NTG) tartalmazó csőbe bemérünk 10 ml spóraszuszpenziót. A csövet rázatva inkubáljuk 28 °C hőmérsékleten 60 percen keresztül, majd a spórákat alaposan kimossuk 1%-os nátrium-klorid oldattal. 3. lépés: A mosott spórákat 1%-os nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, és azonos térfogatú 80%-os etilénglikollal keverjük össze. A szuszpenziót -20 °C hőmérsékleten tároljuk, és sejtforrásként használjuk a mutánsok kereséséhez. A spóraszuszpenziót YPD lemezekre szélesztjük, hogy lemezenként kb. 100 telepet kapunk. A nitrozóguanidinnel kezelt Streptomyces avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs populációjának telepeit az alábbi összetételű agaros táptalajra viszszükát: literenként 80 g hidrolizált keményítő, 1 g diká-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
