201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B a fermentáció alatt. Az avermektinek termelődését minták vételével követjük nyomon. A kivett mintát szerves oldószerrel extraháljuk, és a terméket kromatográfiásan mutatjuk ki, például HPLC-t használva. Az inkubálását addig végezzük, amíg a termék mennyisége maximumot nem ér el. Ez rendszerint 4-5 napot jelent. A hozzáadott primer anyagok - karbonsav - előnyösen mennyisége 0,05-3,0 g literenként. A primer vegyületet hozzáadhatjuk a tenyészethez folyamatosan, megszakításokkal vagy egyszerre. Az RCOOH általános képletű savat adhajtuk szabad sav formájában, sóként, mint például nátrium-, lítium- vagy ammóniumsó vagy a savvá átalakuló vegyüld alakjában. Amennyiben a sav szilárd állapotú, előnyös megfelelő oldószerben, például vízben vagy 1-4 szénatomszámú alkoholban oldani. A fermentációhoz használt táptalaj a szokásos, asszimilálható szén- és nitrogénforrást és nyomelemeket tartalmazó tápközeg lehet. A táptalajt úgy állítjuk össze, hogy ne vagy csak minimális mennyiségben tartalmazza azokat a primer vegyületeket, ahol R jelentése iropropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport. A 24-33 °C hőmérsékleten végzett fermentálás befejeztével a fermentlevet lecentrifugáljuk vagy szűrjük, és a micéliumot előnyösen acetonnal vagy metanollal extraháljuk. Az extraktumot betöményítjük, és a kívánt terméket vízzel nem elegyedő oldószerrel - például mtilén-kloriddal, etil-acetáttal, kloroformmal, butanollal vagy metil-izobutilketonnal - extraháljuk. Az extraktumot betöményítjük, és a nyersterméket a kívánalmak szerint tovább tisztítjuk, például fordított fázisú, preparatív HPLC-t alkalmazva. A nyerstermék általában az (I) általános képletű vegyületek keveréke, ahol R2 jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoport; R1 jelentése hidroxilcsoport és a kettőskötés hiányzik, vagy R1 szubsztituens hidrogénatom és a kettőskötés megvan; és R3 jelentése hidrogénatom. Azok a vegyületek, ahol R3 jelentése metilcsoport, lényegében hiányoznak. Az egyes komponensek aránya azonban erősen változhat az adott mutáns, az alkalmazott primer vegyidet és a használt körülményektől függően. Az itt leírt elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenázt nem tartalmazó mutánsokból három típusú O-metil-transzferáz mutánsokat kaphatunk. A mutánsok, melyekben az elágazó láncú 2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitást nem tartalmazó mutáció egy vagy több O-metil-transzferázt nem tartalmazó mutációval párosul, főként B-avermektineket, demetil-avermektineket vagy egyáltalán nem metilezett avermektineket termeinek, ha RCOOH általános képletű vegyületeket vagy a fermentáció során ezekké átalakuló vegyületeket adunk a tenyészetükhöz. A nevezett mutánsokat úgy kapjuk, hogy az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat ultraibolya fénnyel és/vagy kémiai mutagénekkel, például N-metil-N- nitrozó-karbamiddal, nitrozóguanidinnel vagy más hatóanyaggal kezeljük, mint már fentebb említettük. Ettől eltérő módon az elágazó Iáncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitással rendelkező, de egy vagy 9 több O-metil-transzferáz aktivitásban blokkolt mutánsokat ultraibolya fénnyel vagy mutagén hatóanyagokkal kezelhetjük, olyan mutánsokhoz jutva, melyek nem rendelkeznek elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással. Az ilyen mutánsok által termelt nem-természetes avermektinekre az jellemző, hogy az ágiikon 5-ös szénatomján és/vagy az oleandróz 3’-as szénatom és/vagy 3”-as szénatomján hidroxilcsoportok találhatók. A fent leírt mutánsokat Schulman és munkatársai módszerével [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29: 620-624 (1986)] azonosítottuk. Az így előállított avermektinek azonos céllal és módon használhatók fel, mint az eddig ismert avermektinek. Nagyobb mennyiségű B-avermektint, ideértve azokat, melyek oleandróz diszacharid csoportján hiányzik a metilcsoport, alternatív módon előállíthatunk úgy, hogy a találmány szerinti mutánsokat, melyeknél nincs meg az elágazó láncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitás, szinefungin, S-adenoziletionin vagy S-adenozil-homocisztein jelenlétében tenyésztjük, mely anyagok gátolják az O-metiltranszferáz aktivitást. A találmány szerinti vegyületek magas aktivitású antiparazitikumok, különösen mint antelmintikák, ektoparaziticidek, inszekticidek és akaricidek alkalmazhatók. Ezek szerint a vegyületek hatásosak endoparaziták által okozott különféle betegségek kezelésére, különösen a helmintiázis gyógyítására, melyet leggyakrabban a parazita férgek egy nematódákként leírt csoportja okoz. Ezek súlyos gazdasági kárt okoznak a sertéseknél, juhoknál, lovaknál és szarvasmarháknál és megbetegítenek más háziállatokat és baromfiakat is. A vegyületek hatásosak más nematódákkal szemben is, melyek különféle állatfajokat betegíthetnek meg, ilyenek például a kutyák Dirofilaria parazitái. Alkalmazhatók embereket is megfertőzhető parazitákkal szemben is, ideértve az emésztőrendszerben élő Ancylostoma-t, Necatort, Ascaris-t, Strongyloides-t, Trinchinella-t, Capillaria-t, Trichuris-t, Enterobins-t, valamint a vérben vagy más szövetekben és szervekben található parazitákat, például a Filaria férgeket és a bélrendszeren kívüli állapotban levő Strongyloides-t és Trichinella-t. Sikerrel alkalmazhatók a vegyületek ektoparazitákkal szemben is, ideértve elsősorban az emlősök és madarak ízeltlábú ektoparazitáit, mint amilyenek az atkák, kullancsok, tetvek, legyek, húslegyek, csípő rovarok és a kétszárnyúak; szarvasmarhákon, lovakon élősködő migráló lárvái. A vegyületeket hatásos inszekticidként használhatjuk a háztartásban előforduló rovarokkal, például csótánnyal, ruhamollyal, múzeumbogárral, és háziléggyel szemben, de hatékonyak a raktározott gabonát és mezőgazdasági növényeket károsító rovarok elpusztításában is, mint amilyenek az atkák, levéltetvek, hernyók és a vándorló egyenesszárnyúak, például a sáskák. Az (I) általános képletű vegyületek bejuttatási módja függ attól, hogy miként akarjuk alkalmazni, milyen gazdaállatot kívánunk kezelni vele, és mi-10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
