201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B viszonyban van az ATCC 31272 törzshöz. A Streptomyces avermitilis 1-3 és 7881 törzsek a Budapesti Egyezményben szabályozott viszonyok között Streptomyces avermitilis ATCC 53567, illetve ATCC 53692 megnevezéssel lettek letétbe helyezve az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maryland, USA, ahonnan az ismert jogi rendelkezések mellett beszerezhetők. A S.avermitilis ATCC 31267, AtcC 31271, ATCC 31272 és az NCIB 12121 törzsek mindegyike termel (I) általános képletű természetes avermektineket, ahol az (I) általános képletben a 22 és 23-as szénatomok közötti szaggatott vonal adott esetben kettős kötést jelent; R1 jelentése hidroxdcsoport és csak akkor van jelen, ha nincs kettőskötés; R2 jelentése (II) általános képletű 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoport, melyben belül R3 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport; és R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport. A 4 285 963 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom olyan (I) általános képletű avermektineket ír le, ahol a 25-ös helyzetben a szubsztituens metilcsoport vagy etilcsoport; R1 jelentése hidroxilcsoport és R^jelentése metilcsoport. A jelen találmányban szereplő nem-természetes avermektinek esetében R jelentése nem izopoopilcsoport, vagy (S)-szek-butil-csoport, jelentését az alábbiakban meghatározzuk. Az (I) általános képletű vegyületek bioszintéziséhez felhasznált alapvegyületek a S.avermitilis sejtben és a tápközegben találhatók meg. Ezek a vegyületek az L-valin és L-izoleudn vagy az ezeknek megfeleld 2-oxo-savak lebomlásával keletkeznek a 2-oxo-savnak az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz által katalizált dekarboxilálódásán keresztül, mialatt a termék koenzim-A-val kapcsolódik össze. Jelenlétük magyarázza az izopropilcsoportot és az (S)-szek-butil-csoportot hordozó (I) általános képletű vegyületek egyidejű termelődését. Ezzel természetesen fellép az izopropil- és az (S)-szek-butil-származékok elválasztásának a feladata. Amikor a táptalaj egy adott kiindulási primer vegyületet tartalmaz, a találmány szerinti mutánsok olyan (I) általános képletű vegyületet, vagy ami az általánosabb eset, két olyan (I) általános képletű vegyidet keverékét termelik, melyben R jelentése megfelel az alkalmazott kiindulási vegyületnek. Maximum két termék keletkezhet, melyeket a 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom alapjá tiviálisan R-avermektin B1 és B2 névvel illetünk. Az „R”-csoport természetesen a 25-ös helyzetű szubsztituenst jelenti. így például, ha R jelentése ciklopropilcsoport, a két lehetséges avermektin a következő: triviális név R1 R3 7 ciklopentil-avermektin B1 hidrogén- hidrogénatom atom ciklopentil-avermektin B2 hidroxil- hidrogéncsoport atom A nem-természetes avermektineknél az (I) általános képlet 25-ös helyzetű R szubsztituense nem izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport. Az (I) általános képletű vegyületeket, ahol jelen van a kettős kötés és hiányzik a hidroxilcsoport, dehidrációval állíthatjuk elő (I) általános képletű vegyületekből, ahol R3 jelentése hidroxilcsoport és a kettőskötés hiányzik. A reakciónál előzőleg - például terc-butil-dimetil-szilil-oxi-acetil szármatékként - védjük az 5-ös és 4” helyzetű hidroxilcsoportokat, majd helyettesített tiokarbonil-halogeniddel, például (4-metil-fenoxi)-tiokarbonil-kloriddal reagáltatunk, és a terméket magas forráspontú oldószerben, például triklór-benzolban melegítve dehidratáljuk. A védőcsoportok eltávolítása után hozzájutunk a telítetlen vegyülethez. Ezek a reakciók a szükséges reagensek és reakciókörülmények leírásával szerepelnek a 4 328 335 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban. Az (I) általános képletnek megfelelő vegyületek, ahol R1 jelentése hidrogénatom és a kettőskötés nincs meg, az olyan megfelelő vegyületek katalizátor jelenlétében végzett szelektív hidrogénezésével állíthatók elő, ahol jelen van a kettőskötés és azR1 hidrogénatom. A redukciót elvégezhetjük példáid trisz(trifenil-foszfm)-ródium(I)-klorid alkalmazásával a 0001689 számú európai szabadalmi leírás és az annak megfelelő, 199 569 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom alapján. Az (I) általános képletnek megfelelő vegyületeket, ahol R2 jelentése hidrogénatom az olyan megfelelő vegyületekből állítjuk elő, ahol R2 jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L'Oleandrozil-oxi-csoport, enyhe savas hidrolízissel eltávolítva a 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandróz csoport. A vizes szerves oldószerben végzett hidrolízis eredményeként olyan aglikont nyerünk, mely a 13-as helyzetben hidroxilcsoportot visel. Ezt a terméket azután halogénezzük, például benzolszulfonil-halogeniddel, 13-deoxi-13-halo-származékhoz jutva, amit végül szelektíven redukálunk, például tributil-6n-hidriddel. A nem kívánatos mellékreakciók elkerülése céljából, kívánatos a többi jelenlevő hidroxilcsoportot, például terc-butil-dimetil-szilil-csoporttal védeni. A halogénezés vagy a redukciós lépés után a védőcsoport azután könnyen eltávolítható nyomnyi savat tartalmazó metanolban. Mindezek a reakciók, valamint a szükséges reagensek és az alkalmazott reakciókörülmények szerepelnek a 0002615 számú európai szabadalmi leírásban. A természetes és nem-természetes avermektinek bioszintéziséhez a találmány szerinti S-avermitilis törzsek R-COOH általános képletű vegyületeket (primer vegyületek) használnak fel, ahol R jelentése a fenti. A találmány szerinti eljárásnál, egy elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással és B-avermektin-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező, fent meghatározott S.avermitilis ATCC 53692 törzset, annak mutánsát vagy variánsát aerob körülmények között tenyésztünk asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen sókat és RCOOH általános képletű vegyületet tartalmazó vizes tápközegben. A savat vagy a beoltás idejében adjuk a tápközeghez, vagy bizonyos időközönként 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
