201964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a T-limfociták érését és a makrofágok aktivitását gátló peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201964 B adunk 0,55 ml (4 mmól) klórszénsav-i-butilésztert, majd 0,44 ml (4 mmól) N-metil-morfolin 5 ml dimetil-formamiddal készült oldatát. A kapott vegyes anhidridet 10 percen keresztül -10 °C-on keverjük, majd hozzáadunk 1,5 g (3 mmól) fentiek szerint kapott szabad tripeptid-oxalátot és 0,84 ml (6 mmól) trietil-amint 5 ml dimetil-formamidban oldva ugyanezen a hőmérsékleten. Ezután a reakcióelegyet hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre. Másnap az oldószert vákuumban lepároljuk, a maradékot 50 ml kloroformban oldjuk és az oldatot háromszor 20 ml 1 mól/1 koncentrációjú sósavoldattal és 20 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk. A kapott olajat éterrel megszilárdítjuk, a szuszpenziót szűrjük. így 1,30 g (66%) amorf Boc-Arg^Clj-Sar-Asp^Bul-Val- 0(Bu-t kapunk. Rn = 0,18; Rf4 = 0,24; [a] D = -37,0° (c = 1; metanolban). A fent kapott védett tetrapeptid 1,20 g-ját (1,8 mmól) 2 órán keresztül 40 °C-on kezeljük trifluor-ecetsawal. A reakcióelegyet 60 ml éterrel hígítjuk, a kapott szuszpenziót szűrjük, és a csapadékot éterrel mossuk. A kapott trifluor-acetát-sót 10 ml vízben oldjuk, és 5 ml acetátciklusú anioncserélő gyantával (DOWEX 2 x 8) a trifluor-acetát ionokat acetát ionokra cseréljük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 5 ml 90%-os vizes etanollal szilárdítjuk meg. így 0,6 g amorf H-Arg-Sar-Asp-Val-OH-acetátot kapunk. [ot]20D = -32,3° (c = 1; 10%-os ecetsavban). Aminosavanalízis: Asp 1,03 (1), Val 0,97 (1), Arg 1,00 (1). 2. példa H-Lys-Glu-Thr-OH-hidroklorid és -acetát (B módszer) 3,3 g (11,0 mmól) H-Thrí'Buj-O'Bu.oxalátot 60 ml éterben szuszpendálunk, majd a szuszpenziót oldódásig összerázzuk 30 ml 5%-os, vizes káliumhidrogén-karbonát-oldattal. A szerves fázist elválasztjuk, majd még 20 ml 5%-os, vizes kálium-hidrogén-karbonát-oldattal és 20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradék olajat 20 ml dimetilformamidban oldjuk. Az oldathoz hozzáadunk 4,12 g (9,5 mmól) Z-Glu(0'Bu)-OSu-t. A reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot 50 ml etil-acetátban oldjuk, és az oldatot háromszor 15 ml 10%-os, vizes citromsav-oldattal, kétszer 15 ml 5%os, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 15 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, és vákuumban bepároljuk. így 4,4 g (8,0 mmól) olajszerű Z-GluíO^uj-Thr^Buj-Cr Bu védett dipeptidet kapunk (Rfi = 0,85), amit 50 ml metanolban oldva az 1, példában megadott módon katalitikusán hidrogénezünk. A katalizátor kiszűrése után a szűrletet bepároljuk, és a kapott szabad H-Glu^BuJ-Thr^Buj-O'Bu dipeptidet (Rf2 = 0,22) 20 ml dimetil-formamidban oldjuk. Az oldathoz hozzáadunk 4,77 g (10 mmól) ZLys(Boc)-OSu-t. A reakcióelegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradék olajat 50 ml etil-acetátban oldva a szokásos módon kirázásokkal tisztítjuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd vákuum-9 ban bepároljuk. Az olajszerű bepárlási maradékot éterrel kristályosítjuk. így 4,75 g (74%) ZLys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-OtBu védett tripeptidet kanunk. Olvadáspontja: 114-115 °C; Rra = 0,80; [a] d = -22,8° (c = 1; metanolban). A fenti védett tripeptidet (4,4 g, 5,6 mmól) 40 ml metanolban oldva az 1. példában megadott módon katalitikusán hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után a szűrletet vákuumban bepároljuk, és a maradék olajat 40 ml 6 mól/1 koncentrációjú dioxános hidrogén-klorid-oldatban oldjuk. 15 perc után az oldatból csapadék válik ki. 1 óra elteltével a szuszpenziót 100 ml éterrel hígítjuk, szűrjük, a csapadékot éterrel mossuk. így 2,3 g (91%) amorfH-Lys-Glu-Thr-OH.2HCl tripeptid-dihidroklorid sót kapunk. Olvadáspontja: 213-215 °C (bomlik). [a]2°D = + 2,7° (c = 1,1%os ecetsav-oldatban). A kapott H-Lys-Glu-Thr-OH.2HCl tripeptiddihidroklorid sót 20 ml vízben oldjuk és 7 ml acetátciklusú gyantával (DOWEX 2.8) a klorid ionokat acetát ionokra cseréljük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk, és a maradékot etanollal megszilárdítjuk. így 2,27 g amorf H-Lys-Glu-Thr-OH- acetátot kapunk, [a] d = +3,5° (c = l; 10%-os ecetsavban); aminosavanalízis: Glu 1,01 (1), Thr 1,00 (l),Lys (1,00(1). 3. példa H-Lys-His-Leu-NH2-acetát (C módszer) 2,42 g (10 mmól) H-His-OMe.2HCl-ot 30 ml dimetil-formamidban oldunk, és az oldathoz hozzáadunk 2,8 ml (20 mmól) trietil-amint, majd 5,6 g (11 mmól) Z-Lys-(Z)-OSu-t. Másnak a reakcióelegyet bepároljuk, a maradék olajat 45 ml kloroformban oldjuk, az oldatot kétszer 20-20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A maradék olajat etil-acetáttal megszilárdítjuk. így 4,54 g (80%) Z-Lys(Z)His-OMe-t kapunk. Olvadáspont: 135-136 °C; Rn = 0,45. A fenti védett dipeptidészter 4,0 g-ját (7 mmól) 40 ml meleg metanolban oldjuk, és az oldathoz hozzáadunk 4 ml hidrazin-hidrátot. A reakcióelegyet 3 napon át szobahőmérsékleten tartjuk, majd vákuumban fele térfogatig bepároljuk, és 50 ml éterrel hígítjuk. Az amorf csapadékot szűrjük, és éterrel mossuk. így 3,70 g Z-Lys(Z)-His-N2H3 védett dipeptid-hidrazidot kapunk. Olvadáspont: 150-153 °C; Rn = 0,20. 3,65 g (6,0 mmól) Z-Lys-(Z)-His-N2H3-ot 15 ml dimetil-formamidban oldunk, majd az oldatot - 10 °C-ra hűtjük. Ezen a hőmérsékleten az oldathoz hozzácsepegtetünk 2,5 ml 7 mól/1 koncentrációjú dioxános hidrogén-klorid-oldatot, majd 0,75 ml (6,6 mmól) terc-butil-nitritet 4 ml dimetil-formamidban oldva. A reakcióelegyet 20 percig -10 °C-on keverjük, majd 2,0 ml trietil-amint adunk hozzá, és becsöpögtetünk 1,33 g (7 mmól) Leu-NH2-acetátot és 1 ml trietil-amint 10 ml dimetil-formamidban oldva. A reakcióelegyet 30 percig 0 °C-on keverjük, majd állni hagyjuk szobahőmérsékleten. Másnap a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot vízzel szuszpendáljuk. Az így kapott 3,7 g nyers terméket 30 ml izopropilalkoholból átkristályosít-10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
