201964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a T-limfociták érését és a makrofágok aktivitását gátló peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201964 B A találmány szerinti vegyületeket, valamint azok savaddíciós sóit a szokásos gyógyszerkészítmények formájában használhatjuk fel a gyógyászatban mindenütt, ahol az immunrendszeraktivitásának csökkentésére van szükség. Az (l)-(20) képletű peptidek önmagukban vagy sóik alakjában, célszerűen a gyógyászatban szokásos kikészítési formában kerülnek felhasználásra. Ezek a kikészítési formák (gyógyszerek) szilárd vagy folyékony halmazállapotúak lehetnek, és előállításuknál az ilyen készítmények gyártására szokásos töltő, hígító, stabilizáció fokozó, pH- és ozmózisnyomás-befolyásoló, valamint a formulálást megkönnyítő, illetve lehetővé tevő adalék és segédanyagokat használunk. A leírásban alkalmazott rövidítések megfelelnek a szakirodalomban [BiochemJ., 219, 345. (1984)] általánosan elfogadottaknak. Minden aminosavcsoport „L”-konfigurációjú. A Chc ciklohexil-karbamoil-, az Aad L-a-amino-adipoil-csoportot jelent. Az olvadáspont-meghatározások dr. Tottoliféle készülékben (Büchi, Svájc) történtek. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokat előregyártott kovasavgél adszorbensen (DC-Fertigplatten, Merck) végeztük az alábbi oldószer-elegyekben (a megadott arányok térfogatokra vonatkoznak): (A törzsoldat 6:20:11 arányú piridin-ecetsav-víz elegy.) 1.19:1 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy 2.9:1 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy 3.4:1 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy 4.7:3 arányú etil-acetát-törzsoldat elegy 5.3:7 arányú n-butanol-törzsoldat elegy 6.1:4 arányú n-butanol-törzsoldat elegy 7. 1:1:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-etil-acetátvíz elegy. A kromatogramokat ninhidrinnel, majd klórozást követően kálium-jodid/tolifin reagenssel hívtuk elő. A nagynyomású folyadékkromatográfiás méréseket Labor MIM OE975 típusú, változtatható hullámhosszú UV detektorral, Altex pumpával, valamint KUTESZ 175 típusú rekorderrel végeztük. Az elválasztáshoz 10 p,m szemcseméretű, 18 szénatomos alkil-csoportokkal alkilezett szilikagél állófázisú, 250 mm hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű töltetet (Labor MIM) használtunk. Elúcióra a következő elegyeket használtuk: A. 25 ml metanol és 75 ml, 0,5 térfogatszázalék trifluor-ecetsavat tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú vizes nátrium-szulfát-oldat elegye; B. 1,5:1,0:97,5 arányú acetonitrd/trifluor-ecetsav/desztillált víz elegy. A mérést 1 ml/min áramlási sebességgel végeztük 215 nm-en detektálva az oldat fényelnyelését. A kromatogramok kiértékelését területnormalizációval végeztük. A célvegyületek tisztasága mind nagynyomású folyadékkromatográfiás, mind vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel mérve meghaladta a 95%ot. A fajlagos optikai forgatóképességet Perkin-Elmer 241 típusú polariméterrel határoztuk meg. Valamennyi oldószer-eltávolítási, illetve bepárlási Büchi-féle rotációs vákuum-bepárlón végeztünk 7 40 °C-os vízfürdőn. A célvegyületek aminosavanalízisét Biotronik LC 5001 típusú készülékben határoztuk meg. A mintákat 6 mól/1 koncentrációjú sósav-oldatban 110 °C-on hidrolizáltuk 24 órán keresztül. Az analízis értékei minden esetben a ± 5% hibahatáron belül voltak. A szintézisek kiindulási anyagai az irodalomból jól ismertek. A találmány szerinti eljárás további részleteit a találmány korlátozásának szándéka nélkül a következő kiviteli példákkal szemléltetjük. 1. példa H-Arg-Sar-Asp-Val-OH-acetát (A módszer) 2,58 g (12,0 mmól) H-Val-OlBu.HCl és 4,62 g (11,0 mmól) Z-Asp(OlBu)-OSu 25 ml dimetil-formamiddal készült szuszpenziójához 1,68 ml (12,0 mmól) trietil-amint adunk. Másnap a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot 50 ml etil-acetátban oldjuk, és a szuszpenziót 25 ml vízzel háromszor 25-25 ml 1 mól/1 koncentrációjú sósav-oldattal, háromszor 25-25 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 25 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. így 4,3 g (81,7%) 2L-Asp(OtBu)-Val-OtBu védett dpeptidet kapunk olaj formájában. Rn = 0,85. 4,07 g (8,5 mmól) fenti védett dipeptidet 40 ml metanolban oldunk, és 1,0 g csontszenes Pd-katalizátor jelenlétében keverés közben átbuborékoltatással hidrogénezzük. 2 óra alatt a reakció teljessé válik, ekkor a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet vákuumban bepároljuk, a maradékot 50 ml éterben oldjuk, és az oldat kémhatását pH = 4,-re állítjuk 6 mól/1 koncentrációjú dioxános hidrogén-kloridoldattal. A kivált csapadékot kiszűrjük. így 3,2 g (91,5%) H-Asp(OtBu)-Val-OtBu.HCl szabad dipeptid-hidrokloridot kapunk, olvadáspontja: 187- 189 °C.R{2=0,40. 3,0 g (10,0 mmól) Z-Sar-OSu-t és 3,05 g (8,0 mmól) H-Asp(OtBu)*Val-OtBu.HCL-ot 30 ml dimetil-formamidban oldva reagáltatunk 1,40 ml (10,0 mmól) trietil-amin jelenlétében. Másnap a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a maradékot 50 ml etil-acetátban oldjuk, és a szuszpenziót 20 ml vízzel, kétszer 20-20 ml 1 mól/1 koncentrációjú sósav-oldattal, kétszer 20-20 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A kapott Z-Sar-AspíC^Buj-Val-C^Bu, olaj konzisztenciájú védett tripeptidet (tömege: 4,2 g, 7,6 mmól; Rfi = 0,75) 40 ml metanolban oldjuk, az oldathoz 0,8 g csontszenes Pd-katalizátort teszünk, és az elegyet a szokásos módon hidrogénezzük. A katalizátor kiszűrése után a szűrlethez 1,0 g (8,0 mmól) oxálsav-dihidrátot teszünk. Az oldatot bepároljuk, és a maradékot éterrel megszilárdítjuk, így 2,24 g H-Sar-AspíO^uj-Val-O'Bu.oxalát szabad tripeptid-oxalátot kapunk. Olvadáspontja: 190-192 0C,RO = 0,30. 1,14 g (3,5 mmól) Boc-Arg(HCl)-OH.H20 10 ml dimetil-formamiddal készült oldatát -10 °C- ra hűtjük, az oldathoz ezen a hőmérsékleten hozzá8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
