201964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a T-limfociták érését és a makrofágok aktivitását gátló peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
5 HU 201964 B 2. táblázat 6 egereket hét napon át naponta kezelünk szubkután 1 mg/kg dózisban adott vizsgálandó anyaggal. Ezután az állatokat elvéreztetjük, majd 8 ml, 10 NE heparint tartalmazó, 7,2-es pH-jú PBS puffer-oldattal kimossuk a peritóneumot. Desztillált vizes sokkolással a peritóneumból kimosott sejtszuszpenziót vörösvértest-mentesítjük, majd PBS puffer-oldattal háromszor mossuk. Közben 1000/min fordulatszámon 5 perces centrifugálással ülepítünk. Az egyes sejtszuszpenziók koncentrációját 106 sejt/ml értékre állítjuk, és 37 °C-on 30 percen keresztül ülepítjük a szuszpenziókat 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában Boyden-kamrában. Az üvegfelületre kitapadt makrofágok fölé opszonizált élesztőt rétegezünk. A nem fogocitált részecskék eltávoh'tása után sejtenként megszámoljuk a bekebelezett részecskéket. A 3. táblázat a nem kezelt állatokból izolált makrofág kontrolihoz képest «dja meg a fagocitált élesztősejtek számának %-os csökkenését. 4. A késői típusú túlérzékenységi (DTH) reakcióra gyakorolt hatás A vizsgálatokat 25-30 g-os hím CFLP (LATI) egerekkel végezzük. A vizsgálat kezdetén az egereket vízmentes etanolban oldott 3%-os oxazolon-oldattal kezeljük úgy, hogy 20-20 pl oldatot viszünk fel az egér mindkét fülére és mellső talpára. A kezelés utáni 7. napon az állatokat intraperitoneálisan 1 mg/kg dózisban kezeljük a vegyületekkel, melyeket fiziológiás nátrium-klorid-oldatban oldunk. A kontroll állatokat csak ezzel az oldattal kezeljük. A vizsgálat 10. napján az állatok füleire 20-20 |j,l 2,5%-os olivaolajos oxazolon-oldatot kenünk, és az állatok fülének vastagságát kétszer megmérjük: az antigén adása előtt és 24 órával ezután. A vastagságot mindkét fülön, a fülcimpák közepén mérjük 0,01 mm-es pontossággal. A változást a kontrollcsoporthoz hasonlítjuk. A 4. táblázat a DTH reakció kifejlődésének gátlását adja meg %ban kifejezve. 1. táblázat Az ellenanyag-termelés gátlása %-ban Peptid változás (%) (1) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH-14,4 (2) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-OH-27,1 (3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH-25,5 (4) H-Arg-Sar-Asp-OH-21,5 (5) H-Orn-Lys-Asp-Val-OH-19,5 (8) H-Arg-Lys-Aad-OH-10,6 (10) H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-22,4 H-Arg-Lys-Asp-NH-CH2 (11) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-)2-21,2 (16) H-Lys-Glu-Thr-OH-36,8 (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH-23,2 (18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH-19,4 (10) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH-22,9 (20) H-Lys-His-Leu-NH2-25,3 A H-Arg-Lys-Asp-OH + 68.6 B H-Arg-Lys-Asp-Val-OH + 58,0 C H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH + 46,9 Az elsődleges ellenanyag-termelésre gyakorolt gátlás%-ban Peptid változás a keletien kontrolihoz (%) (3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH -17,9 (4) H-Arg-Sar-Asp-OH -10,7 (11) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-)2 -14,9 (12) (H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH2)2 -10,7 (19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH -10,8 A H-Arg-Lys-Asp-OH +13,7 B H-Arg-Lys-Asp-Val-OH +28,1 C H-Arg-Lys-Asp-V al-T yr-OH +41,3 3. táblázat Nyugvó makrofágok fagocitáló képességének változása Peptid Változás % (%) (1) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH-11,2 (2) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-OH-47,3 (3) H-Arg-Sar-Asp-Val-OH-10,5 (4) H-Arg-Sar-Asp-OH-22,7 (7) H-Arg-Lys-Aad-Val-OH-28,7 (8) H-Arg-Lys-Aad-OH-29,1 (9) (H-Arg-Lys-Asp-NH-CH2-)2-11,6 (11) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-)2-16,5 (12) (H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH2)2-40,1 (14) H-Ser-Lys-Leu-OH-14,0 (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH-17,5 (18) H-Pro-Lys-Leu-Thr-OH-11,7 (19) H-Lys-Lys-Thr-Glu-OH-18,6 (20) H-Lys-His-Leu-NH2-39,6 Cildofoszfamid 150 mg/kg i.p. dózisban-75,0 4. táblázat A DTH reakció kiváltásának gátlása %-ban Peptid Gátlás (%) (I) H-Arg-Lys(Chc)-Asp-Val-OH 39,1 (5) H-Orn-Lys-Asp-Val-OH 28,3 (6) H-Orn-Lys-Asp-OH 39,6 (8) H-Arg-Lys-Aad-OH 36,8 (II) (H-Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-)2 27,0 (12) (H-Arg-Lys-Asp-Cys-NH2)2 35,3 (13) H-Lys-Ser-Lys-Leu-OH 28,2 (14) H-Ser-Lys-Leu-OH 22,7 (15) H-Ser-Ser-Ser-Thr-OH 18,0 (16) H-Lys-Glu-Thr-OH 27,5 (17) H-Lys-Thr-Glu-Thr-OH 35,5 A fenti táblázatokban összehasonlítás céljából megadott „A”, „B” és „C” jelű peptidek a következő anterioritásokból ismertek: „A” és „B”: 185 263 számú magyar szabadalmi leírás; „C”: 4,190,646 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
