201881. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil, nyújtott hatású alfa-interferon komplex előállítására
1 HU 201881 B 2 el, hogy az elnyújtott felszabadulást maximalizáljuk. Ha bizonyos oldható frakció kívánatos az azonnali felszívódáshoz, a komponensek aránya változtatható, vagy előnyösen a pH szabályozható. Az oldahatatlan komplex maximális képződése érhető el, ha az interferon oldatot 8,0-8,4 előnyösen 8,2 pH értékre állítjuk, de ha a pH értéket 7,5 és 8,5 közé állítjuk, akkor lehetőség van oldható rész képződésére az alfa-interferon azonnali felszívódása érdekében. A következő 2. táblázat bemutatja a komplex kéződés változatait a pH változásának függvényében. A találmány szerinti oldahatatlan komplex előállításának előnyös módszere szerint a 4 496 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt módon előállított liofilizált alfa-interfe- 5 ront cink-acetátot és protamin-szulfátot tartalmazó oldattal kezeljük a kívánt pH értéken. A következő példákban bemutatjuk a liofilizált alfa-interferon előállítását és a komplex képzését. 1. példa Liofilizált alfa-interferon 10 2. táblázat Oldhatatlan komplex képződés a pH függvényében Eloszlás 700 nm-nél pH 0,2 7,0 1,12 7,5 2,64 8,0 2,64 8,3 2,64 8,4 1,80 8,6 Az alfa-interferonnak a komplexből való felszabadulása nem mérhető in vitro, mivel nem szolubilizálódik hígításra, csak fizilológiás kelátképzők, valamint szérum albumin hatására. Az in vivo felszabadulási hányadot radiokatív jóddal jelezett alfa-interferonnal mérhetjük és az injekciós helyen a radioaktivitás csökkenését, valamint a szérumban és a vizeletben a radioaktivitás jelenlétét követjük. Patkányokon végzett vizsgálatok több, mint két hétig mutatták az elnyújtott hatást. A találmány szerinti készítményekben az alfa-interferon mennyisége 2xl06-200xl06 nemzetközi egység (I.U.) a komplex 1 ml-ére vonatkoztatva, előnyösen 2xl07 I.UVml. A cink mennyisége 1-20 mg cinksó/ml lehet, és cinksóként cink-acetátot, cink-kloridot, vagy cinkszulfátot, előnyösen cink-acetátot használhatunk. A protamin mennyisége 0,25-5 mg/ml, előnyösen 2,5 mg/ml, és a protamint szabad bázisként, protaminkloridként, protamin-foszfátként vagy protamin-szulfátként alkalmazhatjuk, előnyös a szulfát használata. A HSA 0-10 mg/ml, előnyösen 0,5-1 mg/ml koncentrációban van jelen. Az interferon oldat előállításához bármilyen kémiailag és győgyszerészetileg összeférhető puffer használható, előnyös a foszfát puffer használata. Az interferon oldatok maximális stabilitása 6,5-8,0 pH értéknél, előnyösen 7,0-7,4 pH értéknél van (4 496 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az interferon oldatnak 7,5-8,5 pH értékre való beállításához a komplex képzés előtt előnyös a nátrium-hidroxid. A puffemek nem lehet nagy affinitása a cinkhez, mivel ez a komplexből a cink eltávolítását eredményezné. A cink iránti affinitásmentesség különösen jelentős, ha glicin van jelen, mivel a glicin cink kelátképző; glicin távollétében azonban a puffemek a cink iránti bizonyos affinitása elviselhető. A cink iránt bizonyos affinitással rendelkező puffer (például citrát vagy acetát) használható az oldható frakció növelésére az interferon azonnali felszabadulása érdekében. Liofilizálási oldat mg/ml 15 20 Alfa2-interferon 2xl07 I.U. Vízmentes kétbázisos nátriumfoszfát (reagens minőség) 2,27 Egybázisú nátrium-foszfát (USP) Glicin, USP Humán albumin, USP Injekciós víz, USP 0,55 20,00 1,0 1,0 ml-re kiegészítve 25 Az injekció víz (USP) egy részét keverővei felszerelt megfelelő edénybe töltjük. Ezután sorban hozzáadjuk és keverés közben feloldjuk a vízmentes kétbázisos nátrium-foszfátot, egybázisú nátrium-foszfátot, humán albumint és alfa2-interferont. Ezt köve- 30 tőén az oldatot injekciós vízzel feltöltjük a végső térfogatra. Az oldatot környezetben aszeptikusán steril tartályba töltjük, steril 0,2 mikronos szűrőn keresztül, amelyet előzőleg mostunk és hibátlanságát ellenőriz- 35 tűk. A szűrő hibátlanságát a szűrés után is ellenőrizzük. Az oldatot aszeptikusán steril üvegcsékbe töltjük, ezeket steril liofilizáló berendezésbe helyezzük és az oldatot liofilizáljuk. Az üvegcséket aszeptikusán du- 40 gaszoljuk, lezárjuk és csomagoljuk. 2. példa Alfa-interferon komplex Alkotórészek mg/ml Liofilizált alfa2-interferon üvegcsébe (lásd az 1. példát) Cink-acetát 4,0 Protamin-szulfát 2,5 Nátrium-hidroxid 0,6 Injekciós víz 1,0 ml. 55 A liofilizált alfa2-interferont az injekciós víz egy részében oldjuk. Nátrium-hidroxiddal a pH-t 8,2-re állítjuk be. Ezután hozzáadjuk a protamin-szulfátot és keverjük, majd hozzáadjuk a cink-acetátot és keverjük. Az oldatot a maradék vízzel a kívánt 60 végtérfogatra egészítjük ki. A nátrium-hidroxidot, protamin-szulfátot és cink-acetátot előnyösen tömény vizes oldat alakjában alkalmazzuk (például protamin esetében 100 ml 25 mg/ml-es vizes oldatból). Nyers alfa-interferon oldatok (azaz liofilizálatla- 65 nők) vagy más alkalmas alfa-interferon minták is 3
