201881. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil, nyújtott hatású alfa-interferon komplex előállítására
1 HU 201881 B 2 A találmány tárgya eljárás oldhatatlan cink-protamin-alfa-interferon komplex előállítására, amely alfa-interferon injektálható, elnyújtott hatású beadására alkalmas. Injekciós gyógyszerkészítmények jól ismertek (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 16. kiadás, 1980). Ezek a készítmények általában diszperziók, így kolloidok, emulziók és szuszpenziók. Utóbbi időben polimereket tartalmazó elnyújtott hatású injekciós készítményeket is használnak. A jellegzetes elnyújtott hatású injekciós készítmények vizes vagy vízzel elegyedő szuszpenziók, de ezeknek a szuszpenzióknak a stabilitása gyakran kifogásolható és a készítményben a hatóanyagnak a visszatartási ideje nem elég hosszú egyrészt a diszperzió megtörése miatt, vagy azért, mert a diszperzió oldhatósága a környezeti testfolyadékokban (például a vérben és a nyirokrendszerben) túl nagy. Egy sikeres vízalapú elnyújtott hatású szuszpenzió példája a protamin-cink-inzulin szuszpenzió. Az United States Pharmacopeia (USP) a szuszpenzióra megad egy szabványos összetételt, amely 40-100 USP inzulin egység/ml-t tartalmaz cink (0,15-0,25 mg cink/100 USP inzulinegység) és protamin (1-1,5 mg protamin/100 USP inzulinegység) vizes oldatában 7,1-7,4 pH értéken. A pH értéket jellegzetesen 0,15-0,25 tömeg/tf% kétbázisos nátrium-foszfáttal tartják fenn és a készítmény 1,4-1,8 tömeg/tf% glicerint, 0,18- 0,22 tömeg/tf% krezolt vagy 0,22-0,28 tömeg/tf% fenolt is tartalmaz. Az inzulin koncentrációjától és a betegek állaőpotától függően egy injekció az inzulint legalább 3 napig adja le. Az interferonok a fehérjék egy családját képezik, amelyek vírus ellenes hatásúak bizonyos vírusok ellen, továbbá bizonyos daganatokkal szemben is daganatellenes hatást mutatnak. Az interferonok természetes vagy rekombináns alfa(leukocita), béta(fibroblaszt), és gamma(immun) interferonokat foglalnak magukba, de a találmány szerinti készítményben előnyös az alfa-interferon használata. A természetes humán alfa-interferon legalább 11 komponens elegye, amely magábafoglalja az álfái- és alfa2 interferonként jelölteket, utóbbi különösen előnyösnek tekinthető. A természetes alfa-interferonnal hasonló biológiai tulajdonságokat mutató humán alfa-interferon előállítható rekombináns módszerekkel. Az alfa2-interferon előállítási módszereit ismerteti Rubenstein, Biochem. Biophys. Acta., 695, 5-16 (1982); Nagata és munkatársai, Nature, 284, 316-320 (1980); 32 134 számú európai szabadalmi leírás és 4 289 690 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A találmány szerinti eljárásban felhasználhatók az ún. alfa hibrid interferonok, is amelyekben két vagy több natív alfa-interferon species fragmensei vannak összekapcsolva (lásd például az 51 873 számú európai szabadalmi leírást). Beszámoltak arról, hogy az alfa2-interferon parenterális beadása hatásosnak bizonyult a Kaposi-féle szarkóma, bazális sejt karcinóma, többszörös mielóma és vírusos szemölcs kezelésében. Az alfa-interferon hatásos adagját a szakember egyszerűen meghatározhatja. A találmány tárgya eljárás cinket, protamint és alfa-interferont tartalmazó oldhatatlan komplex, valamint glicint és humán szérumalbumint (HSA) tartalmazó komplex elegy előállítására. Míg az ismert cink-protamin-inzulin komplex inszolubizációja az említett három komponenstől függ, a találmány szerinti cink-protamin-alfa-interferon komplex előnyösen tartalmaz egy második proteint, a humán szérum albumint annak érdekében, hogy az oldhatatlan komplex maximálisan képződjön, továbbá meglepő módon moláris feleslegig tartalmazhat glicint, egy cink kelátképzőt. A találmány szerinti oldhatatlan komplex képzésének előnyös módszere szerint az oldathoz a protamint a cink hozzáadása előtt adjuk, hogy biztosítsuk az oldható protein legkisebb mennyiségének a felülúszóban való maradását, továbbá, hogy az oldhatatlan komplex finom kolloid részecskék alakjában legyen, amelyek hosszú ideig diszperzióban maradnak, ahelyett, hogy könnyen ülepedő, nagy kolloidaggregátumok képződnének. Az oldhatatlan komplex képzésének másik módszere a protamin és a cink egyidejű hozzáadása. A következő 1. táblázat különböző komponensek elhagyását és a cink és protamin hozzáadáséi sorrendje a hatását mutatja olyan készítmény példáján, amely 1 mg HSA/ml, 0,1 mg alfa-interferon (IFN)/ml és 20 mg glicin (G)/ml összetételű 0,02 mólos foszfát pufferban (p). Az első oszlop a hozzáadási sorrend hatását mutatja; ha először a cinket adagoljuk, 5% oldható protein képződik, ezzel szemben, ha először a protamint adagoljuk, akkor kevesebb, mint 1% oldható protein képződik. A 3., 4. és 5. oszlop azt szemlélteti, hogy puffer nélkül, illetve puffer és glicin nékül, illetve HSA nélkül nem képződik maximális mennyiségű komplex, mivel legalább 5% oldható protein származik midegyik ilyen kombinációnál. Míg a 2. oszlop azt mutatja, hogy glicin jelenléte nem szükséges maximálisan oldhatatlan komplex képzéséhez, az 1. oszlop azt igazolja, hogy a glicin nem meghatározó a komplexre cink keletkező tulajdonságai ellenére, amennyiben a protamint a cink hozzáadása előtt adjuk. 1. táblázat Az oldható protein talált mennyiségének függése az összetételtől és a cink/protamin hozzáadás sorrendjétől Összetétel Hozzáadás HSA/IFN HSA/IFN HSA/IFN HSA/IFN IFN sorrendje (p/G) (P) (H20/G) (H2O) (H2O) Cink/protamin 5% <1% 10% 5% 5% Protamin/cink <1% <1% 10% 5% 5% A találmány szerinti készítményben a glicin 0-50 mg/ml mennyiségben van jelen, a találmány szerinti készítmény előállítására előnyösen használt liofilizált interferonban való jelenléte eredményeképpen. Hivatkozunk a 4 496 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásra, amely szerint puffert, glicint és HSA-t adnak az interferon oldatokhoz liofilizálás előtt a biológiai stabilitás biztosítására. Az oldhatatlan komplex képződése egyensúlyi jelenség, és amint az az 1. táblázatból megállapítható, csaknem teljes inszolubilizálás (azaz 99%-os) érhető 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
