201874. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, biológiailag aktív hatóanyag, és ezt az anyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201874 B 2 téréssel, hogy az eluálást izooktán, metanol és etilacetát 4:1:1 térfogatarányú elegyével végezzük, és az egyes frakciók alikvotjait a fentiek szerint digoxin-radioimminassay módszerrel megvizsgáljuk. Az erdményeket az 5. ábrán mutatjuk be. A találmány szerinti eljárással előállított anyag a gluzalázos emésztés után hamarabb eluálódik, mint az emésztetlen anyag (az 1. ábrával összehasonlítva). Ez az eredmény összhangban van az előbbiekben ismertetett extrakciós tulajdonságokkal, bizonyítva, hogy a találmány szerinti eljárással előállított biológialilag aktív anyag egy szteroid-konjugátum. A hidrolízis nem változtatja meg az ezekben a frakciókban jelenlévő biológiailag aktív anyag mennyiségét, amint ezt a digoxin-immunvizsgálat eredményei mutatják. Ez azt jelenti, hogy sem a konjugátum tulajdonságai, sem annak jelenléte vagy távolléte nem befolyásolják ezt a vizsgálatot. A találmányt a fentiekben a legelőnyösebb megvalósítási módokra hivatkozva ismertettük. Nyilvánvaló azonban, hogy bizonyos utólagos műveleteket végrehajthatunk, vagy azokat elhagyhatjuk és/vagy módosíthatjuk anélkül, hogy a találmány oltalmi körén kívül kerülnénk. 5. példa Egyszerűsített extrakciós és tisztítási eljárás Az 1. típusú emlő ciszta folyadék 100 ml-ét azonos térfogatú acetonitrillel elegyítjük, és az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítjuk. Az extraktumot (felülúszót) azonos térfogatú etil-acetáttal elegyítjük, és választótölcsérben két fázisra választjuk szét. Az alsó, vizes fázist eldobjuk. A felső fázisból eltávolítjuk az illékony oldószereket a szokásos rotációs bepárlókészülék (Buchler, Fort Lee, NJ, USA) segítségével, vákuumban, szobahőmérsékleten, és a maradék folyadékot liofilizálással távolítjuk el. A liofilizátumot 5-10 ml metanollal extraháljuk, és 1,9x30 cm-es Sephadex LH-20 oszlopra (Pharmacia, Pistcataway, NJ, USA) visszünk, amelyet ugyanezen oldószerrel készítettünk. 5 ml-es frakciókat szedünk, és az alikvotokat szárazra pároljuk, majd a fent ismertetett módon meghatározzuk a digoxin-ekvivalens tartalmat. Az eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be. A biológiailag aktív anyagot tartalmazó 11-14. frakciókat összegyűjtjük és nitrogénatmoszférában, szobahőmérsékleten szárazra pároljuk. A biológiailag aktív anyagot HPLC oszlopon (LKB, Gaithersburg, MD, USA) tisztítjuk tovább, amino-szénhidrát töltetet (Alltech, Chicago, IL, USA) használva. Az oszlopot 95 térfogat % acetonitril és 5 térfogat % víz elegyéből kiindulva, 55 térfogat % acetinitril és 45 térfogat % víz elegyével végződő 20 percen koncentráció-gradienssel eluáljuk. Az eluálást izokratikusan (azaz nem gradiens, hanem állandó koncentrációt alkalmazva) is végezhetjük, ugyanezen acetonitril:víz arányokat alkalmazva; vagy metanol és víz elegyével, vagy gradiens eluciót, vagy izokratikus eluciót alkalmazva. 0,5 ml-es frakciókat szedünk, percenként 1 frakciót. Az eluciós profil a 7. ábrán látható. A 19. és 20. frakciókat tartalmazza vizsgálataink szerint a biológiailag aktív anyagot. Ezeket a frakciókat újra HPLC- oszlopba injektáljuk, amelyben ugyanezt az adpszorbenst (amino-szénhidrátot) alkalmazzuk. A második amino-szénhidráttal töltött oszlop eluciós profilját a 8. ábrán mutatjuk be. A 22. frakció tartalmazza a tisztított, biológiailag aktív anyagot. 6. példa Ouabain-kötődés stimulálása az ouabain-receptorokoz a biológiailag aktív anyag által A találmány szerinti eljárással előállított, tisztított biológiailag aktív anyag meglepő módon stimulálja az ouabain kötődését a sejt-felületen lévő ouabain receptorokhoz. Ez a legmeglepőbb tulajdonsága a biológiailag aktív anyagnak, mivel az a sejtben lévő Na+, K+-ATPáz enzimet is stimulálja, míg az ouabain ezt az enzimet közismerten gátolja. A vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük. MarhatűdŐt 0,25 mól/1 koncentrációjú szacharózoldatban homogenizálunk, 3:1 térfogat:tömeg arányban, Waring- homogenizátorban, és a homogenizátumot GSA rotort (Dupont Sorval, Wilmington, DE, USA) alkalmazva 7000 g-vel és SA-600 rotort (Dupont Sorval, Wilmington, DE, USA) 38000 g-vel 30-30 percen keresztül centrifugálva differenciál-centrifugálásnak vetjük alá. A kapott nyers mikroszkomális preparátumot 20% glicerint tartalmazó 1. pufferben (összetétele: 100 mmól/1 NaCl, 50 mmól/1 Tris/HCl, 0,25 mmól/1 Na2-EDTA, 5 mmól/1 MgCte, pH-7,4) újraszuszpendáljuk, a marhatűdő friss tömegének 3 g-jára vonatkoztatva 1 ml térfogat arányban. Az ouabain receptorokhoz való kötődését úgy határozzuk meg, hogy 3H-ouabaint (New England Nuclear, Boston, MA, USA) 0,5 mmól/1 ATP-t tartalmazó 1. pufferben inkubáljuk. Ezután hozzáadjuk a szobahőmérsékleten, nitrogénáramban szárazra párolt, és 1. pufferben újraoldott biológiailag aktív anyag alikvot mennyiségeit. A biológiailag aktív anyagból csövenként kb. 1 és 50 pikogramm digoxin ekvivalensnek megfelelő mennyiségben adunk. Hozzáadunk 50 ml marhatűdő mikroszóma preparátumot, és az elegyet 37 °C-on 2 órán keresztül inkubáljuk a jelzett ouabain (5 nCi [3H]-oabain) hozzáadása előtt, majd 37 'C-on 20 percen keresztül inkubáljuk a jelzett ouabain-tracer hozzáadása után. Az inkubálás befejezése után az elegyet 10 percen keresztül jeges fürdőn hűtjük. A kötött ouabaint szűréssel választjuk el a kötetlentől, a szűréshez üvegszál-szűrőt (GFC Filteres, Whatman, Springfield, NJ, USA) használunk. A biológiailag aktív anyag a fent ismertetett körülmények között a kezdeti 9%-tól a hozzáadott mennyiségben kb. 20%-ig növelte az ouabain-kötődést, ami 2,2-szeres növekedést jelent. Az eredményeket a 3. táblázatban ismertetjük. 3. táblázat Hozzáadás Kötött CPM* % kötő protein 761 9,3 kötő protein+10 ml (1,2 pg) 1039 12,8 kötő protein+15 ml (1,8 pg) 1234 15,2 kötő protein+25 ml (3,0 pg) 1437 17,7 kötő protein+50 ml (6,0 pg) 1688 20,8 *[3H]-ouabain-bevitel«8099 CPM 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
