201874. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, biológiailag aktív hatóanyag, és ezt az anyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201874 B 2 mában kapszulába zárhatjuk, vagy tablettává formálhatjuk. Az egyes kapszulákban vagy tablettákban a hatóanyag mennyisége nem kritikus, hiszen a teljes dózist egyetlen tabletta vagy kapszula beadásával ugyanúgy biztosíthatjuk, mint több kapszula vagy tabletta adagolásával. A kapszulák bármely ismert gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazhatnak; például zselatint, cellulózszármazékokat, vagy hasonló anyagokat. A kapszulák a biológiailag aktív anyag megfelelő mennyiségét megfelelő oldószerben, például polietilénglikolban (USP), etil-alkoholban (USP), tisztított vízben (USP), vagy ezek elegyében oldva tartalmazzák. A tablettákat a gyógyszerkészítésben szokásosan használt formálási eljárásokkal állíthatjuk elő, szilárd hordozóanyagok, csúsztatóanyagok, stb. alkalmazásával. Szilárd hordozóanyagként például keményítőt, cukrot, bentonitot, vagy más, szokásosan használt hordozóanyagot használhatunk. A találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyagot meg is száríthatjuk, és kemény burkolatú tabletta, vagy például kötőanyagként laktózt vagy mannitot, és szokásosan alkalmazott töltőanyagokat és tablettázó anyagokat tartalmazó kapszula formájában adagolhatjuk. A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal ismertetjük. Ezekben a példákban leírjuk az endogén biológiailag aktív anyag extrahálására, tisztítására, jellemzésére és alkalmazására szolgáló módszereket. I. példa Biológiailag aktív anyag izolálása humán női emlőciszta-folyadékból 1. lépés: Extrahálás 250 ml humán női emlőciszta-folyadékhoz - amelyet makroszkópikus méretű emlőcisztában szenvedő nőkből tü-biopsziával nyertünk - 250 ml metanolt adunk. Az elegyet 16000 g-vel centrifugálva eltávolítjuk a denaturált proteineket és az egyéb oldhatatlan anyagokat. A csapadékot eldobjuk. A maradék felülúszót azonos térfogatú (500 ml) acetonitrillel elegyítjük, szobahőmérsékleten 10 percen keresztül állni hagyjuk, és a denaturált és oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából centrifugáljuk. A csapadékot eldobjuk. A felülúszóból az acetonitrilt és metanolt rotációs bepárló segítségével (Buchler, Fort, Lee, N.J., USA), 40 °C-os vízfürdőn eltávolítjuk. A kapott 200 ml vizes fázist 200 ml acetonitril és 200 ml etil-acetát elegyével újraextraháljuk. Az alsó, vizes fázist elöntjük, és a szerves fázist vákuumban a fentiek szerint bepároljuk. A maradék 63 ml vizet liofilizálással távolítjuk el az extraktumból. A szilárd anyagot 10 ml 1:1 térfogatarányú metanol-víz eleggyel extraháljuk, és az oldhatatlan anyagokat centrifugálással távolítjuk el, a fentiek szerint. A végső extraktumot szérum-ampullába helyezzük és a metanol-víz oldószert szobahőmérsékleten, nitrogéngázárammal eltávolítjuk. A végtermék (K3) 1 800 ng digox in ekvivalensnyi biológiailag aktív anyagot tartalmaz, míg az eredetileg gyűjtött mintában a biológiailag aktív anyag mennyisége 7,2 ng digoxin ekvivalensnek felel meg. 2. lépés: Kromatográf álás Sephasorb HP oszlopon Az 1. lépés végtermékét Sephasorb HP (Pharmacia, Piscataway, N.J., U.S.A.) töltetű, 2,5 cm széles, 30 cm magas SR-25 oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot metanol és víz 1:1 térfogatarányú elegyével eluáljuk. Az eluálást 200 ml/óra átfolyási sebességgel alulról felfelé végezzük, WIZ Model P szivattyú (ISCO, Lincoln, N.B., U.S.A) segítségével. 60 4 ml-es frakciót szedünk. A mintákat két négyállású szelep (SRV-4, Phasrmachia, Piscataway, N. J., U.S.A.) segítségével 1,8 ml-es részletekben visszük fel az oszlopra. A fenti eljárásban alkalmazott összes anyag, amely az oldószerárammal érintkezésben került, rozsdamentes acél, Teflon vagy bór-szilikát üveg volt, a nemspecifikus kötődés elkerülésére. Az 1. lépés szerint előállított, összesen 9 ml térfogatú végterméket így 5 részletben kromatografáltunk. A kromatográfiás úton nyert frakciók alikvotjait a New England Nuclear (Boston, MA, U.S.A.) által előállított reagensekkel vizsgáltuk a 2. példában ismertetett módon a digox in-immunreaktivitás szempontjából, a gyártó által előírt feltételek mellett, azzal az eltéréssel, hogy az antitestekből és a jelzőanyagból egyaránt 0,2 ml-eket használunk az előírt 0,5 ml helyett. Ezt a változtatást a vizsgálat érzékenységének növelésére hajtottuk végre. Az eredményeket az 1. ábrán ismertetjük. Az oszlopról négy, aktív anyagot tartalmazó csúcsot eluálunk. Ezt a humán cord-szérum eluciós profilját bemutató 4. ábrával hasonlítjuk össze, amely a digoxin-antitestekkel szintén ad keresztreakciót, de nem mutat vérnyomáscsökkentő aktivitást. A humán cordszérumból izolált aktivitásnak csak igen kis hányada található abban a kromatográfiás régióban, amely a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag csúcsát tartalmazza, Sephasorb HP oszlopon azonos körülmények között végzett kromatográfiás eljárást alkalmazva. Az immunreaktivitást mutató csúcsoknak megfelelő frakciókat (K3A: 12-22; frakció; K3B:23-26 frakció; K3C:32-36. frakció; K3D:27-31 frakció; összegyűjtjük, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a vizet liofilifálással távolítjuk el. 3. lépés: K3B frakció kromatografálása Sephadex LH-20 oszlopon, acetionitril és víz 7:3 térfogatarányú elegyével, mint eluenssel A 2. lépésben a 23-26. frakciók egyesítésével kapott K3B csúcsot Sephadex LH-20 oszlopon kromatografáljuk, az eluálást acetonitril és víz 7:3 térfogatarányú elegyével végezzük. Az 1,9 cm széles, 30 cm magas oszlopot felülről lefelé, a gravitáció segítségével eluáljuk, és 40, egyenként 2,7 ml térfogatú frakciót szedünk. Az oszlopra közvetlenül visszük fel az 5 ml térfogatú kromatografálandó mintákat. Ezután további oldószert alkamazunk, amíg az aktív frakciók eluálódnak. Az egyes frakciókban a biológiailag aktív anyag mennyiségét a fent említett eljárással határozzuk meg. Az eredményeket a 2. ábrán ismertetjük. A biológiailag aktív anyagot a 16-22. frakciók tartalmazzák. A 16-22. frakciókat összegyűjtjük, liofilizálással szárítjuk, és Sephasorb HP oszlopon újrakromatografáljuk. A csúcs-aktivitást a 22-26. frakciók tartalmazzák, amely bizonyítja a fenti anyag természetének reprodukálható voltát (az előzőekben ugyanezen az oszlopon az anyagcsúcs a 23-26. frakciókban található). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
