201874. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, biológiailag aktív hatóanyag, és ezt az anyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201874 B 2 4. lépés: Kromatográf álás Sephadex LH-20 oszlopon, metanollal, mint eluenssel A második Sephasort) HP oszlopról izolált 22-26. frakciókat a 3. lépésben leírtak szerint újrakromatografáljuk, azzal az eltéréssel, hogy az eluálást metanollal végezzük. Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. A hatóanyag a 19-22. frakciókban eluálódik. Az egyes csúcsokat külön-külön összegyűjtjük, és liofilizálással szárítjuk. Az egyes frakciókat 2 ml vízben újraoldjuk, és liofilizálással szárítjuk, majd ebben az állapotban tároljuk. 2. példa Digoxin immunreaktivitás meghatározása A találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag jelenlétét digoxin-antitesetekkel való kötődés alapján mutatjuk ki. A vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük. Az ismert mennyiségű digoxint tartalmazó standard oldatokat a gyártó cég (New England Nuclear, Boston, MA, U.S.A., katalógusszám: A082) által előállított standardok hígításával állítjuk elő. A standard görbék meghatározására 0,05 , 0,1 0,2 0,5 1,0 és 2,0 ng/ml digoxint tartalmazó oldatokból 0,1 ml-t adunk a 12x75 mm-es bór-szilikát kémcsövekbe (Fischer Scientific Co.), és az alábbiak szerint vizsgáljuk. Az ismeretlen mintákat 12x75 mm-es kémcsövekbe pipettázuk, és nitrogéngáz-áramban szárazra pároljuk. 0,2 ml 125I-jelzett digoxin-tracert és 0,2 ml digoxinantitestet adunk minden egyes kémcsőhöz. A kémcsövek tartalmát rázogatással összekeverjük, és 30 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a kémcsöveket 2600 g-vel 4 °C-on 30 percen keresztül centrifugáljuk, habot szűrő rácsra [Diagnostic Products, Los Angeles, CA., USA) visszük és dekantáljuk. Az egyes csövek tartalmát felcseppentjük, és a 125I mennyiségét gamma-számlálóval (Model 1275 Minigamma, LKB, Gaithersburg, MD, U.S.A.) meghatározzuk. Az egyes digoxin-értékeket az ugyanekkor felvett standard görbéből határozzuk meg interpoláció segítségével, az LKB-től kapott, egyeneshez legjobban illeszkedő programm segítségével, és digoxin-ekvivalensben adjuk meg, a fentiekben ismertetett módon. 3. példa Endogén biológiailag aktív anyag vizsgálata Minden kísérletben 270-305 g tömegű, Spargue- Dawley patkányokat használunk. Négy állatot intraperitoneálisan adagolt, 30-40 mg/testtömeg kg dózisú pentobaritollal altatunk. A jobb nyaki verőérbe, a bal 1. felületi nyaki vénába és a húgyhólyagba katétereket vezetünk. A sebészeti beavatkozások végeztével az állatoknak a testtömeg 0,5%-ának megfelelő menynyiségben 0,15 mól/1 koncentrációjú nátrium- klorid- 5 oldatot injektálunk, kezdő vese-terhelés biztosítására. A vese-funkció vizsgálatára 0,045 ml/perc kezdeti sebességgel 0,15 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldat infúziót adunk, amely 14C-inulint és 3HPAH-ot (para-amino-hippursavat) (New England Nuc- 10 lear, Boston, MA., U.S.A.) tartalmaz, 5 mikroCi/óra, illetve 10 mikroCi/óra radioaktivitást biztosító mennyiségben. Egy 40-50 percen át tartó ekvilibrációs periódus után indítjuk a kísérletet. Az intraarteriális vérnyomást transzduktor és nyolc- 15 csatornás fiziográf (Beckman, Palo Alto, CA., U.S.A.) segítségével regisztráljuk. A vérnyomásmérőt kézi vérnyomásmérő segítségével kalibráljuk. A hematokrit értékeket a szokásos eljárásokkal mérjük. A 14C-inulin és a 3H-PAH plazmában és vizeletben lévő aktivitását 20 béta-szcintillációs számlálóberendezés (Rackbeta, LKB Instruments, Caithersburg, MD., U.S.A.) segítségével mérjük. A plazma-elektrolitok mennyiségét lángfotométerrel (Klinaflame, Beckman Instruments, Palo Alto, CA., U.S.A.) mérjük. A glomeruláris filt- 25 ráció sebességét (GFR) és a vese vérátáramlását a 14C-inulin és 3-PAH clearance értékekből számítjuk ki, a szokásos egyenletek alkalmazásával. Első kísérletben az 1. típusra, nagy káliumionkoncentrációjú humán női emlőciszta-folyadékból kapott 30 25-szörös koncentrátum (K3) 1% alikvotját (17 ng digoxin ekvivalens) 1 ml 0,15 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és a teljes mennyiséget intravénásán injektáljuk. A második és harmadik kísérletben az 1. típusú, 35 nagy káliumion-koncentrációjú humán női emlőciszta-folyadék (K3) újabb 1% alikvotját oldjuk 2 ml 0,15 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldatban, és ebből 1 ml-t injektálunk (8,5 ng digoxin ekvivalens). A negyedik kísérletben az 1. példa 4. lépésében 40 kapott anyagot (K3B, 19-22. frakció, amely az eredeti emlőciszta-folyadék 100-szoros koncentrátuma) 1 ml 0,15 mól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldatban oldjuk, és ebből 0,2 ml-t injektálunk (13,5 ng digoxinekvivalensnek felel meg). 45 A vérnyomást folyamatosan regisztráljuk a vizsgált időtartama alatt. Minden 30 percben 0,3 ml térfogatú vérmintát veszünk,és azonos térfogatú sóoldattal pótoljuk. Megbízható vizelet-mintavételt csak az első kísérletben sikerült biztosítani; az utóbbi három kí- 50 sérletben technikai problémák megakadályozták a vese-funkció mérését. Kísérlet Injektált anyag Injektált Kezdeti Legalacso Idő Hematokrit érték száma térfogat vérnyomás nyabb vérnyomás (perc) max. válaszig Kezdeti Végső 1* nyers ciszta-folyadék 1,0 ml 105-110 25-szörös koncentrátuma (K3) 60 20 39 20 2. nyers ciszta-folyadék 1,0 ml 115 25-szőrs koncentrátuma (K3) 2,0 ml-ben oldva 90 150 52 36 6
