201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására
HU 201844 B A találmány tárgya a vizelet-plazminogén aktivátor zimogénnek (pro-uPa = urinary plasminogen activator precursor), (általánosan használt elnevezéssel urokináz) biológiai folyadékokból, valamint bármilyen, ezeket tartalmazó oldatokból külön-külön vagy együttesen történő szelektív meghatározására vonatkozó új eljárás. Az eljárás egyik jellegzetessége valójában abban áll, hogy még enzimatikusan aktív származéka, az u-PA jelenlétében is lehetővé teszi a pro-uPa meghatározását. A találmány szerinti új eljárás pontos, megbízható, gyors és könnyen kivitelezhető. A vizsgálaton belüli és a vizsgálatok közötti pontosság a jelenleg analitikai célokra elfogadott értéktartományba esik. A találmány szerinti eljárásnak megfelelően az u-Pa és/vagy a pro-uPa-n és az u-PA-n lévő szokásos epitóp felé irányul. A mintákat az enzimatikus aktivitás szempontjából az enzimatikusan inaktív zimogén aktiválásával, illetve anélkül vizsgáljuk. E meghatározás pontossága annak a ténynek is tulajdonítható, hogy a mintából könnyen eltávolíthatók a szennyeződések és az interferáló anyagok a vizgált anyag(ok) immunabszorpciója után. A plazminogén aktivátorok (PA) szerin-proteázok, melyek a plazminogént plazminná alakítják. A plazmin a fibrinre — a véralvadék fő alkotórészére — erősen specifikus proteáz. A plazminogén aktivátoroknak legalább két, immunológiailag különböző típusát izolálták malignus sejtvonalak tenyészetéből: a szöveti plazminogén aktivátorral (TPA= tissue plasminogen activator) rokon (1. Rijken D.C., Wijngaard G., Zaal-de Jong M., Welbergen J., 119191, Biochem. Biophys. Acta 380,140), illetve a vizelet aktivátorral (u-PA, más néven urokináz) rokon típus (Williams J. R. B. /1951/, Br. J. Exp. Pathol. 32, 530). Az u-PA típust eredetileg kettős fehérjeláncként állították elő tisztított formában a vizeletből, újabban a — pro-uPA-nak nevezett — proenzim formájában izolálták, például humán epidermoid karcinoma sejtek HEp3 vonalából (Wun T. D., Ossowsky L., Reich E. /1982/ J. Bioi. Chem. 257, 7262), humán glioblasztoma sejtekből (Nielsen L. S. et ál. /1982/ Biochem. 21,641), vizeletből (Húsai S. C. et al. /1983/ Arch. Biochem. Biophys. 220, 31), vlamint a TCL-598-as humán vese állandó sejtvonalából (Kohno T. et al. /1984/ Biotechnoi. 2,628). Egy, az u-PA-val immunológiailag rokon proenzimet az A431-es humán epidermod karcinoma sejtvonal felúszójából is azonosítottak. Ez a pro-uPA zimogén egyetlen 50-54000-es molekulatömegű fehétjeláncból áll, amidolitikus aktivitása nincs vagy alacsony, fibrin-affmitása magas, diizopropil-fluoro-foszfát kezelésére és plazma inhibitorokkal történő inaktiválásra rezisztens (1. Gurewich V. et al. /1984/ J. Clin. Invest. 73, 1731), és plazminnal végzett kezeléssel kettős láncú aktív enzimmé (u-PA) alakítható. A humán u-PA molekulát két, biológiailag aktív formában izolálták: egy nagy molekulatömegű forma (MS körülbelül 54000) és egy kis molekulatömegű forma (MS körülbelül 330). A kis molekulatömegű forma (LMW = low molecular weight) a 1 nagy molekulatömegű (HMW = high molecular weight) keletkezik, enzimatikus hasítással. A nagy molekulatömegű forma egy 30000-es nehéz láncból (B-lánc) és egy 20000-es könnyű láncból (A-lánc) áll, melyek diszulfid-kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A kis molekulatömegű forma az aktív helyet hordozó egész B-láncot tartalmazza, továbbá egy, a diszulfid-kötéssel kapcsolódó A- láncból származó kis, fehérjebontás szempontjából ellenálló fragmensből áll (MS = 2,427). Az A-lánc proteolízissel két ffagmensre bontható, egy 18000- es molekulatömegűre és a fenti, 2,427-es fragmensre. A kis molekulatömegű u-PA keverés aktív a nagy molekulatömegű u-PA-nál, az olvadék lizisének meggyorsítása tekintetében, in vivo (M. Samama et al., Thromb. Haemostas. 40, 578-580119191, G. Murano et al., Blood, 55, 430-436 /1980/). A humán u-PA-t jelenleg főként normál és tumoros vese-sejtkultúrákból nyerik, hagyományos tisztítási eljárások segítségével. A humán u-PA zimogén hasonló fiziológiai szerepet játszhat u-PA-vá történő aktiválódását követően. A fent megadott számok Dalton-ban értendők. Újabb közlés szerint humán u-PA-t állítottak elő, DNS-technológia segítségével (92182. sz. európai közrebocsátási irat). Az u-PA fibrinolitikus aktivitását fibrin-lemezes módszerrel (Plough J. et al. /1957/ Biochem. Biophys. Acta 24,278), az amidolitikus aktivitást acetil-lizil-metil-észteren (ALME) pedig a Sherry és munkatársai által leírt módszer módosításával határozzuk meg (Sherry et al. /1964/ J. Láb. Clin. Med. 64,145). Más esetben az u-PA fibrinolitikus aktivitása a piro-glutamil-glicil-arginil-p-nitroanilid (S2444) szintetikus szubsztrát segítségével állapítható meg. 0,1 ml mintát, 0,1 ml sertés-plazmint (Sigma, 25 p.g/ml) és 0,8 ml 1% bovm szérum albumint (BSA) tartalmazó 0,1 M pH=8,8-as Tris-HCl puffert 1 órán át 20 °C-on inkubáltunk. A mintákat amidolitikus aktivitás szempontjából különböző időpontokban vizsgáltuk. A plazmin reakciót 10 pl pufferben oldott 100 p,g aprotinin (Richter) hozzáadásával állítottuk le. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy mind a pro-uPA hatékonyságának megítélése, mind pedig a kezelt betegek plazma-szintjeinek rutinszerű ellenőrzése szempontjából szükség van egy pontos, megbízható, gyors és könnyen kivitelezhető módszerre. Ezt a célt szolgálja a találmány szerinti eljárás. E módszer alkalmas továbbá az u-PA és/vagy a pro-uPA analizálására komplex közegben is, amilyen például a sejt- vagy mikroorganizmus tenyésztésére alkalmas táptalaj. A találmány egy másik lehetséges alkalmazási területe biológiai nedvekben vagy bármilyen vizes közegben a nagy molekulatömegű u-PA — például kis molekulatömegű u-PA-vá vagy annak bármilyen más lebomlási termékévé történő átalakítása következtében való — eltűnésének vizsgálata monoklonális vagy poliklonális antitest készítmény alkalmazásával, mely képes a nagy molekulatömegű u-PA felismerésre — a kis molekulatömegű u-PA-éra azonban nem — mint például az alábbiakban részletesebben ismertetendő 5B4-es monokolonális an2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
