201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására

HU 201844 B

titest.

A „biológiai folyadék” kifejezést a találmány alkalmazása során olyan értelemben használjuk, amely felöleli az emberi biológiai nedveket, azaz a plazmát, a vizeletet, az exszudátumokat stb. éppúgy, mint a sejtek és mikroorganizmusok tenyésztésére alkalmas táptalajokat. Ez utóbbiak között különösen jellegzetesek az u-PA és/vagy a pro-uPA előállítására képes és rekombinált DNS-sel rendelkező mikroorganizmusok tenyésztésére alkalmas táptalajok, továbbá az u-PA és/vagy a pro-uPA termelő sejtek tenyésztésére való táptalajok, mint például az emberi epidermoid kardnoma sejtek vagy a normál és tumoros humán vesesejtek. Azt is tekintetbe kell vennünk, hogy minden, amint a „biológiai folyadékban” végzett meghatározásról elmondtunk, érthető és alkalmas a vizsgált anyag bármilyen más oldatban történő kimutatására is. Az egyszerűség kedvéért a vizsgált anyag bármilyen oldatát, illetve a találmány szerinti eljárás során alkalmazható bármilyen biológiai folyadékot a továbbiakban „vizsgált oldatnak” fogunk nevezni. A „vizsgált anyag”(ok) kifejezéssel az u-PA-t (humán vizelet plazminogén aktivátor) és/vagy a pro-uPA-t (annak enzimatikusan inaktív prekurzorát) jelöltük a leírásban és a szabadalmi igénypontokban.

Részletesebben, a találmány szerinti eljárás a következő lépésekből áll:

(i) a vizsgálandó oldatot egy analitikai segédanyaggal hozzuk érintkezésbe, amelynek felülete a következő tulajdonságokkal jellemezhető monoklonáiis antitesttel van bevonva:- az IgGi osztályba tartozik,- az antigénhez HT6—10'11 affinitású,- specifikusan kötődik a nagymolekulatömegű (54000 D) u-PA-hoz, illetve annak prekurzorához (azaz a pro-uPA-hoz) anélkül, hogy megkötné a kismolekulatömegű (33000 D) formát),- anélkül, hogy kötődne a szérumban vagy a vizeletben lévő endopeptidázokhoz,- anélkül, hogy gátolná az u-PA enzimes aktivitását, illetve a pro-uPA enzimes aktiválását,- izoelektromos pontja 5,5 és 6 között van,

(ii) pufferes öblítést követően a kezelt analitikai segédanyagok egyik sorozatához valamilyen enzimatikus aktivátor pufferes oldatát adjuk, ugyanakkor ezzel párhuzamosan a kezelt analitikai segédanyagok egy másik sorozatához csak a pufferoldatot adjuk;

(iii) az így kapott oldatok koncentrációját az önmagában ismert amidolitikus módszer szerint határozzuk meg szintetikus szín-előhívó szubsztráton, standard görbéhez viszonyítva; az u-PA koncentrációját közvetlenül azon mintákból határozzuk meg, amelyeket az (ii) lépésben nem kezeltünk az enzimatikus aktivátorral, míg a pro-uPA koncentrációját az enzimatikus aktivátorral kezelt, illetve csak a pufferrel kezelt mintákban mért vizsgált anyag koncentrációinak különbsége alapján határozzuk meg.

A találmány szerinti eljárás céljának megfelelően az „analitikai segédanyag” kifejezés vonatkozhat bármilyen analitikai eszközre, mely folyékony reagenseket képes tartalmazni, vagy legalábbis azok hatásának kitehető lehet. Előnyös példák erre az

3

üveg vagy műanyag mikr otiter es lemezek vagy kémcsövek, a műanyag lemezek, a nitrocellulóz és a nylon membránok. A legelőnyösebb „analitikai segédanyagok” a polietilén, a polisztirol vagy a polivinil-klorid mikrotiteres lemezek vájatai képviselik.

Azóta, hogy megjelent C. Milstein és G. Köhler [Nature, 256, 495-497 (1975)] áttörő jelentőségű munkája a monoklonális antitesteket termelő sejthidridekről, az u-PA-val szembeni monoklonális antitesteket is leírták. A következő irodalmi közlemények számoltak be például urokinázzal (u-PA) szembeni antitestekről:- 896.253. számú belga szabadalmi leírás,- Bioscience Reports 3,373-379 (1983),

- Thromb. Haemostas. (Stuttgart) 49, 24-27

(1983) ,

- 0084344. számú európai közrebocsátási irat,- Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 110-114

(1984) ,- Biochemistry, 21,6410-6415 (1982),- Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 3720-3273 (1982).

A találmány szerinti eljárás során történő felhasználása esetén a monoklonális antitest antigén iránti affinitásának 10^-nál nagyobbnak kell lennie, előnyösen a Tsapis és munkatársai által leírt módszerrel [Eur. J. Biochem. 64,369 (1976)] mérve.

A fenti körülmények között az affinitás 10*7 és 10'10 közé esik.

Különösen előnyös, a találmány szerinti eljárás során alkalmazható monoklonális antitest az 5B4- nek nevezett monoklonális antitest, mely a következő tulajdonságokkal jellemezhető:

a) az IgGi osztályba tartozik;

b) affinitási állandója l,42xl071/mól, előnyösen a Tsapis és munkatársai által leírt módszerrel (Eur. J. Biochem. 64,369 /1976/) mérve;

c) specifikusan köti az u-PA nagy molekulatömegű (54000 D) formáját, illetve annak prekurzorát (azaz a pro-uPA-t) anélkül, hogy megkötné a kis molekulatömegű (33000 D) formát, illetve az u-PA — szérumban vagy vizeletben lévő — tromboplasztin szennyeződését;

d) megköti az A-lánc 18000 D-os amino-terminális fragmensét;

e) nem csökkenti az u-PA enzimatikus aktivitását;

f) nem gátolja a pro-uPA enzimatikus aktiválását;

g) izoelektromos pontja 5,75.

Laemmli U. K. és munkatársai (Nature 227,680, /1970/) u-PA és pro-uPA SDS-poliakrilamid-gélelektroforézist (SDS-PAGE-t) végeztek redukáló és nem redukáló feltételek között. Salerno G. és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 110 /1984/) immunbiot vizsgálatokat végeztek, lényegében a fent leírtak szerint. Az immunreakciók során tiszta 5B4 típusú monoklonális antitestet, antiuPA-t és szövet-ellenes PA antiszérumot alkalmaztak.

Az 5B4-es monoklonális antitest immunbiot képe interakciókra utal a nagy molekulatömegű u- PA-val és a nagy molekulatömegű u-PA A-láncából származó proteolitikus fragmenssel (18000). Ez arra mutat, hogy az epitópnak az A-láncon kell lennie.

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3