201843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és eszköz antibiotikus hatású gátlóanyagok maradékai és egyéb kemikáliák jelenlétének meghatározására
HU 201843 B Napjainkban ez a két utóbb említett teszttörzs vált a tej gátlóanyag-tartalmának vizsgálatára a legszélesebb körben elteijedetté. A tejidegen, antibakteriálisan ható anyagok kimutatására legjobban a Bacillus stearothermophilus var. calidolacds C 953 nevű és jelű baktériumtörzs teijedt el számos kedvező tulajdonság miatt. Nálunk horváth és Szepes vizsgálataikban a C 953 jelű törzset vékonyrétegben végzett agardiffúziós módszerrel alkalmazták. (Lásd: Horváth I. - Szepes G.: Magyar Állatorvosok Lapja, 1978. 4. 237.) Elvégezték ennek a rendszernek és néhány egyéb tesztbaktériumot tartalmazó eljárásnak a tőgykezeléseknél leginkább igénybevett antibiotikumokkal történő összehasonlítását. A Bacillus subtilis ATCC 6633, a Staphylococcus aureus ATCC 6538, a Micrococcus luterus (korábbi nevén Sarcina lutea) ATCC 9341 és az Escherichia coli ATCC 9637 nemzetközi standard törzsekkel végzett egybevetés során a calidolactist találták a vizsgált hat antibiotikum (penicillin, sztreptomicin, neonácin, oxitetraciklin, klorafenikol és eritromicin) iránt a legérzékenyebbnek. A vékonyrétegben inokulált agarlemezeken legnagyobb érzékenységgel a penicillint (6 NE/1) és az eritromicint ( 20 (ig/1); legkisebb, de még mindig igen jó határértékkel a sztreptomidnt és a neomicint (80 p.g/1) tudták detektálni. (Lásd: Horváht I. - Szepes G.: Magyar Állatorvosok Lapja. 1978. 4. 273; Lombai Gy. és munkatársai: Magyar Állatorvosok Lapja, 1987.3. 165.) Lombai és munkatársai a 80-as évek elején — saját összehasonlítóvizsgálataik, majd több száz tejminta (később vér- és szöveti minta) vizsgálati tapasztalatának birtokában- a C 953 jelű törzs általuk optimalizált rendszerét általános elterjesztésre ajánlották. E szerint- Acalidolactis törzset spóraszuszpenzió formájában (lehetőleg liofilezve) tartották fenn és inokulálták.- Elszaporításra a Nouws-féle táplevest használták. A törzselszaporítást és a teszt inkubálását 63 °C- on végezték.- Inokulum-táptalajként a Mueller-Hinton agart használták.- Indikátorként a baktériumtörzsre közömbös, gyorsan reagáló brillantfekete festéket (redoxi-indikátor) találták alkalmasnak.- A gátlózóna 0,1 mm-es pontossággal olvasható le, a reprodukálhatóságot a 10% alatti relatív szórás jellemzi. (Lásd: Magyar Állatorvosok Lapja 1982, 37(2)75-79.) Szintén Lombaiék állapították meg, hogy az optimalizált metodika rutinszerű alkalmazásának egyéb feltételei is adottak; a törzs liofilezett spóraszuszpenziója, a táptalajok és az esetleges egyéb eszközök nagyüzenuleg, standard minőségben előállíthatók. (Lásd: Bánhidi Á. és munkatársai: Philaxia Állategészségügyi és Takarmányozási Közlemények., 1985.1.21.; Lombai Gy. és munkatársai: Magyar Állatorvosok Lapja 1987.3.165.) A tejben előforduló antibiotikum maradékok meghatározására Magyarországon a magyar QUANT1TEST, ezen kívül két külföldi gyártmány 3 (mindkettő holland) és egy magyar eljárás ismeretes. A QUANTITEST (összetétel: Id. Hsz. 3708- 83,2-3. old.) a tej antibiotikum-tartalmának kimutatására szolgáló készlet, mely diagnosztikai készítmény szilárd (Mueller-Hinton agar) és folyékony (Nouws-leves) tápközegből, indikátorból (brillantfekete) és liofilezett spóraszuszpenzióból (C 953) áll. A DELVOTEST a Gist-Brocades NV készítménye. A DELVOTEST-et a tejipar importálta és számottevő mennyiséget használt fel az egészségügy is, azonban felhasználása a devizaigényesség és a beszerzés nehézkessége folytán erősen visszaesett. Streptococcus thermophilus törzset brómkrezol-bíbor indikátorral alkalmazták az Intervet International B.V. holland vállalat INTEREST nevű diagnosztikai készítményében. A liofilezett baktérium és az indikátor mellett növekedést elősegítő és stabilizáló komponenseket is tartalmazó gömböcskék, illetve töltött mikrotitrátor lemezek formájában kerül forgalomba. A tejmintákat az alkalmazást megelőzően a nem specifikus gátlóanyagok eliminálása céljából forralásig kell hevíteni, majd 45 °C-ra lehűtve 2,5 ml-hez egy tesztgömböcskét adni (illetve 0,1 ml-t a tesztlemezen egy lyukba mérni). 1-2 percnyi elegyítés után 45 °C-on 4 óra az inkubálás ideje. A gátlóanyag hiányát a törzs zavartalan elszaporodása és savtermelése következtében a brómkrezol-bíbor sárga színátcsapása jelzi. Ellenkező, tehát pozitív esetben az elegy Ulás színű marad. Az esetleges kékes-zöldes árnyalatok kétes reakciókat jelentenek. Jelentős érzékenységi különbségeket mutat, e mellett az is hátránya az eljárásnak, hogy az inkubáció hőmérséklete, a 45 °C nem elég magas a tej természetes gátlóanyagainak zavaró hatásának, illetve a szennyező kísérő mikrobák okozta mikroökológiai interferenciáknak a kiküszöbölésére. Az egységes gátlóanyag-kimutatás érdekében országos szabvánnyal is rendelkezünk. „Tejidegen antibakteriálisan ható anyagok kimutatása tejben és juhtejben” címmel 1984. július 1-től lépett hatályba a jelenleg is érvényes MSZ 3708-83. A szabványkarbantartás során 1983-ban korszerűsített változat mind döntő, mind alternatív eljárásainál a Bacillus stearothermophilus var calidolactis C 953 használatára épít, az IDF (International Dairy Federation, Kay, H. W.: Milchwissenschaft, 1969.24. 596.) említett elvi ajánlásával összhangban. A szabvány döntő módszere agarlemez-diffűziós eljárás, gyakorlatilag megegyezik a QUANTITEST metodikával. A találmány szerinti megoldás célkitűzése, hogy — elsősorban a tejipar és a tejtermelők számára— csak minőségi szűrővizsgálatra alkalmas módszert, eljárást és azt lehetővé tevő diagnosztikai eszközt biztosítson, amit nem kell devizáért beszerezni, hazai gyártása megoldható, működési elve pedig garantálja, hogy a vizsgálat gyors, egyszerű és biztonságos. Felismertük, hogy a teszt érzékenysége és egyértelmű leolvashatósága (biztonsága) úgy fokozható, hogy előinkubálást végzünk. Ennek révén éljük el ugyanis, hogy a teszttörzs egységeit egyszerre és olyan fejlődési stádiumban hozzuk érintkezésbe az 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
