201843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és eszköz antibiotikus hatású gátlóanyagok maradékai és egyéb kemikáliák jelenlétének meghatározására
HU 201843 B antibiotikus hatású anyaggal, amikor a reakciókészségben minőségi ugrás állapítható meg. A találmány szerinti eljárás lényege, hogy a teszttörzset spóraszuszpenzió formájában alkalmazzuk, a tesztanyagot a vizsgálat előtt 63 ± 2 °C-on, előnyösen 2 órán át előinkubáljuk, az inkubálást megelőző diffundáltatást pedig előnyösen 30 percig, szobahőmérsékleten végezzük. A találmány szerinti eszközt az jellemzi, hogy— átlátszó edényben elhelyezett — kocsonyás állagú, különlegesen elkészített brillantfekete festékoldattal kékre színezett Mueller-Hinton táptalajt tartalmaz, amely betöltés előtt egy, a gátlóanyagok iránt nagyon érzékeny baktérium, célszerűen Bacillus stearothermophylus var. (calidolactis C 953 nevű és jelű teszttörzs spóráival lett keverve. A találmány szerinti diagnosztizáló eszköz lényeges előnye, hogy míg az ismert tesztanyag csak készletben tartalmazza a vizsgálathoz szükséges anyagokat, így a felhasználónak magának kell a diagnosztikumot előállítani, mindehhez pedig mikrobiológiai laboratóriumi szakismeretekre és magára a laboratóriumra is szükség van, addig a találmány szerinti készítmény azonnal használatba vehető termék, melyet mikrobiológiai szakismeret és laboratórium nélkül bárki alkalmazhat. Egyszerűsége, olcsósága és viszonylagos gyorsasága alkalmassá teszi arra is, hogy minőség szerinti átadás-átvétel esetén (pl. a tejtermelő és a tejipar között) mindkét fél elvégezze a vizsgálatot, az eredményt pedig több napig rögzíteni képesek. A találmány értelmében felhasznált baktérium a DELVOTEST-ével azonos nevű és jelű, illetve annak egy változatlan érzékenységű, de gyorsabban spórásodó, szelekcióval elkülönített genetikai vonala. Kísérleteink során azt találtuk, hogy a vizsgálat idejét kb. 40%-kal lerövidíthetjük és érzékenységét kb. kétszeresére fokozhatjuk, ha a tesztanyagot — a találmány értelmében — még a vizsgálat megkezdése, azaz a minta rátöltése előtt — akár a megelőző napon — 63 + 2 °C-on 2,5-4, előnyösen 2 órán át előinkubáljuk. A kimutatást úgy hajtjuk végre, hogy a vizsgálandó folyadékból — ami az előzőekben felsoroltak bármelyike lehet — 1 ml-t töltünk rá a tesztanyagra. Tej és vérplazma esetén azonnal inkubálhatunk, a többi anyagnál, elsősorban szövetnedveknél (hús és zsigerek vizsgálatánál) előbb 30 percig szobahőmérsékleten diffundáltatunk, majd a mintafolyadék maradékát elöntjük és csak ezután helyezzük az edényként 63 ± 2 #C-ra 2,5 de legfeljebb 4 órán át. A megfelelő hőmérséklet bármilyen egyszerű, kisméretű szabályozható vízfürdővel, pl. bébi-étel melegítővel vagy joghurt-készítő háztartási eszközzel biztosítható. A teszt kiértékelése a következőképpen történik. Negatív esetben a tesztanyag teljes magasságában megsárgul. Pozitív esetben, tehát ha a mintafolyadék kimutatható, egy alacsony küszöbértéknél nagyobb mennyiségű gátlóanyagot tartalmazott, annak koncentrációjától függően a magasság felső 173-1/2 része, illetve teljes egésze kék marad. Az elbírálási állapot hűtőszekrényben -10 °C alatt 1 hétig megőrizhető. 5 A próba érzékenysége 2r-3 NE/1 penicillin. A többi gátlóanyagra a teszttörzsnek megfelelően ilyen arányban reagál. A Nouws-levest a találmány értelmében megfelelő koncentrációban pufferrel láttuk el, pH értékét a legkedvezőbb tartományba sikerült beállítanunk, valamint módosítottunk a hőkezelésben is. Ezáltal nemcsak az inokulumtáptalaj előállítása válik megbízhatóbbá, hanem a liofilezett spóraszuszpenzió gyártásából kiiktatható a Takács-féle törzsfenntartó agar. Ugyancsak megváltoztattuk a festékoldat komponenseinek egymáshoz, illetve a Mueller- Hinton agárhoz viszonyított arányát is. További újdonság, hogy előzetes kezeléssel az érzékenység megnövekedett, a vizsgálat időszükséglete pedig lecsökkent. A találmány szerinti megoldást a következőkben közelebbről, példa kapcsán ismertetjük. Példa A) Bacillus stearothermophylus var. calidolactis C 953 spóra szuszpenzió készítése A műanyag kupakkal vagy vattadugóval zárt üvegben levő Nouws leveseket 63 °C-ra melegítjük és aszeptikus körülmények között üvegenként egy, a teszttörzs liofilezett spóraszuszpenzióját tartalmazó ampulla anyagával oltjuk. 4 órás 63 °C-os inkubálás után a leves feltűnően zavarossá válik, kezdődő üledék képződéssel. A levestenyészetet aszeptikus körülmények között a lehető legrövidebb időn belül Takács törzsfenntartó agar felületére oltjuk; palackonként (1 literes „benzines üveg” Salgótarján) 5 ml levestenyészetet számítva. A beoltott palackokat 1 hétig 63 °C-on inkubáljuk, majd 4 ®C-ra helyezzük 1-3 hónap időtartamra. A + 4 °C-on bekövetkező spórásodás ellenőrzésére havonta egy palack tartalmát fiziológiás konyhasó oldattal lemossuk úgy, hogy kb. 5 ml spóraszuszpenziót nyerjünk. A kellő spóratartalmú (lásd Quantitest készlet ellenőrzése) bakteriológiailag tiszta tenyészeteket aszeptikus körülmények között fiziológiás sóoldattal lemossuk úgy, hogy palackonként 3-5 ml baktériumszuszpenziót nyerjünk. Az egységesített baktériumszuszpenziót védőkolloid felhasználása nélkül 1 ml-ként liofilezzük. B) Táptalajok készítése 6 Nouws leves Tryptone Oxoid 100 g Laktóz Art 3026 Merck 40 g Yeast extract Oxoid 75 g Ionmentes víz ad 10000 ml pH: 7,4 Letöltés 100 ml-ként gyógyszerüvegbe. Sterilezés áramló gőzben 0,2026 x 10 Pa 40 perc. Takács törzsfenntartó agar ”Lab-Lemco” húskivonat 100 g Tryptone Oxoid 40 g Yeast extract Oxoid 20 g nátriumklorid alt. 20 g dinátrium-hidrogén-foszfát alt 20 g agar-agar SO BI GÉL 160 g Letöltés 130 ml-ként 11-es „benzines üvegében, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
