201808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározására és reagens készlet az eljárás megvalósítására
HU 201808 B 9 10 4. táblázat Alkalmazott sejt MT beütés számx A sejtek száma a mintában beütésszám5' DHFR molekulaszám a mintában kópia szám Kontroli-sejt (DHFR-CDNS nélkül) 182 1,05 xlO6 21 106 I. sejtvonal 138 0,9 xlO6 80 3 xlO6 3 II. sejtvonal 210 1,25 xlO6 732 5 xlO7 40 x A vak-filter leolvasási értékének levonása után kapott beütésszám. Az alkalmazott MT gén egy belső marker, amely a mintákban jelen levő sejtek számának mércéjét. Az eredményekből látható, hogy ebben a tesztben a 106 sejt MT-specifikus beütésszáma 165 + 20. A DHFR reagens méri a DHFR-cDNS mennyiségét. A sejtek számát az MT-specifikus szignál kivonásával állapítottuk meg. Mint a 4. táblázat mutatja, lehetővé vált a DHFR-cDNS kópiaszámának különböző sejtvonalakban történő meghatározása. 3. példa A hírvivő RNS mennyiségének kvantitatív meghatározása a) Nukleinsavreagensek és ezek előállítása A 2. példában ismertetett teszt-szondák alkalmazásával a DHFR-cDNS eredetű hírvivő RNS mennyisége is meghatározható. A pMTVdhfr plazmid szerkezete olyan, hogy a DHFR gén átíródása az NMTV promoternél kezdődik. A kapott messengerek körülbelül 1,0 kilobázis hosszúságúak, s ebből körülbelül 0,25 kilobázis hosszúságú szakasz az MMTV promoter-részéből, a többi pedig a DHR-cDNS-ből származik [Lee és munkatársai: Nature, 294,228-232 (1981)]. Standard szondák A sejt-standard nukleinsav, a standard detektor és standard befogó szonda ugyanaz, mint amelyeket a 2. példában leírtunk. Teszt szondák A teszt nukleinsav, a teszt detektor és teszt befogó szonda azonos a 2. példában leírttal. b) A standard görbe meghatározása A standard görbe felvételénél alkalmazott minta in vitro transzkripció útján keletkezett dihidrofolát-reduktáz génnek megfelelő hírvivő RNS. A transzkripcióhoz szükséges DNS-t úgy állítottuk elő, hogy a pMTVdhfr plazmid MMTV promoterének HindlII fragmensét - amely 1,4 kilobázis hosszúságú - és a DHFR-cDNS HindlII-Bgim fragmensét - amely 0,75 kilobázis hosszúságú - egymás mellé pSP64 plazmidba (Promega Biotec) klónoztuk a HindlII és BamHI restrikciós enzimek hasítási helyei közé. Az RNS mintát 0,2%-os vizes 20 nátrium-dodecil-szulfát oldatban tároltuk. A szendvics hibridizációs tesztet az l.b. és 2.b. példák szerint folytattuk le, azzal az eltéréssel, hogy a denaturálási műveletet elhagytuk. A görbe adatait az 5. táblázat mutatja. 25 5. táblázat A mintából származó molekulák száma/teszt beütésszám DHFR filter 0 20 5 xlO6 65 K)7 130 5 x 107 390 108 653 c) A hírvivő RNS molekulák számának meghatározása 40 A DHFR-génnek megfelelő mRNS molekulák számát a 2. példa szerinti sejtvonalak felhasználásával határoztuk meg. A sejtlizist nátrium-dodecil-szulfáttal idézzük elő, majd a DNS-t vékony injekcióstűn való átpré- 45 seléssel daraboljuk fel. A homogenizátumból 250 (jlI mintát veszünk, amely körülbelül 5 x 106 sejtnek felel meg, majd a homogenizátumot denaturálás nélkül hozzáadjuk a szendvics hibridizációs elegyhez. A szendvics hibridizációt a 2.c. és l.b. 50 példa szerint folytatjuk le, azzal az eltéréssel, hogy csak a DHFR-szondákat adjuk hozzá a hibridizációs elegyhez. Egy párhuzaos kísérletben a 250 p.1 homogenizátumból álló mintában a sejtek számát MT-szonda alkalmazásával a 2.c. példában ismer- 55 tetett módon határozzuk meg. Az eredményeket a 6. táblázat mutatja. 6
