201808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározására és reagens készlet az eljárás megvalósítására
HU 201808 B 11 12 6. táblázat Alkalmazott MT A sejtek száma DHFR sejt beütésszámx a mintában beütésszám* a molekulák száma a mintában mRNS//sejt Lsejtvonal 380 3,5 xlO6 1465 3,45 x 108 2x10* 100 Il.sejtvonal 430 4,2 xlO6 4800 500 x A vakfilterre leolvasott értéket levonva kapott beütésszám. Az eredményekből látható, hogy az I. sejtvonal sejtenként körülbelül 100 molekula mRNS-t (DHFR-géneredetű), a II. sejtvonal pedig sejtenként körülbelül 500 molekula mRNS-t (DHFR-géneredetű) termelt. 4. példa Oldatos hibridizációkor bekövetkező génamplifikáció meghatározása a) Nukleinsav reagensek és előállításuk Standard szondák Az alkalmazott sejt-standard nukleinsav, standard detektor- és standard befogó-szonda azonos a 2. példában leírttal. A pAT153 plazmidba beépített 1,2 kilobázis hosszúságú EcoRI-KpnI-(HindIII) fragmenst 125I-jelzett dezoxi-citidinnel nicktranszlációs próbával jelöljük. Az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág-vektorokba beépített 0,8 kilobázis hosszúságú KpnI-BglII fragmenseket PhotoprobeR reagens (Vector Laboratories, CA, USA, termékszám: SP-1000) segítségével biotinnal modifikáljuk. Teszt szondák Az alkalmazott teszt nukleinsav, a teszt detektor- és teszt befogó-szonda azonos a 2. példában leírttal. A pAT153 plazmidba beépített 0.75 kilobázis hosszúságú HindlII-BglII fragmenst 125I-jelzett dezoxi-citidmnel jelöljük. Az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág-vektorokba beépített 1,4 kilobázis hosszúságú fragmenseket a fent ismertetett PhotoprobeR reagens alkalmazásával biotinezzük. b) A standard görbék meghatározása A sejt-standard görbét a sejtek ismert mennyiségeinek alkalmazásával vettük fel oly módon, hogy az MT-gént felismerő standard szondák segítségével mértük a hibridizációs elegyben mérhető szignált. A teszt nukleinsav standard görbét pMTVdhfr plazmid, valamint az ezt a plazmidot felismerő teszt-szondák segítségével határoztuk meg. A hibridizációs kísérleteket 0,6 mól nátrium-kloridot, 20 mmól foszfát-puffért (pH 7,5), 1 mmól etiléndiamin-tetraecetsavat és 4% polietilén-glikolt (PEG 6000) tartalmazó 200 pl térfogatú oldatban, 70 °C hőmérsékelten, 1,5 óra alatt folytattuk le. A hibridizáció lejátszódása után az elegyhez 50 pl sztieptavidin-agarózt (Bethesda Research Laboratories, USA, termékszám: 5942SA) és 1 mól nátrium-kloridot, 10 mmól nátrium-foszfátot (pH 7,5) és 1 mmól etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldatot adunk 500 pl végtérfogat eléréséig. A hibrideket sztreptavidin-agarózon 37 °C-on, 15 percig 15 fixáljuk, majd az agarózt 5 percig 37 °C-on pufferolt 1 mólos nátrium-kloriddal, majd kétszer 2-2 percig pufferolt 1 mólos nátrium-kloridot tartalmazó 1,5 mmólos nátrium-citráttal mossuk. Az agarózon megkötött hibridek mennyiségét gamma-számláló 20 segítségével határozzuk meg [Syvänen és munkatársai: Nucleic Acids Res. 14., 5037-5048. (1986)]. Az eredményeket a 7. és 8. táblázat mutatja. 25 30 35 40 45 50 55 60 7. táblázat A mintában levő sejtek beütésszám száma/teszt MT-szonda esetén 0,8 x 106 162 1,6 x 106 216 3xl06 298 8. táblázat A mintában levő sejtek beütésszám száma/teszt DHFR-szonda esetén 106 148 5 xlO6 394 5 xlO7 2240 A gének számának meghatározása A 2. példa szerinti sejtvonalakat az ott leírtakkal analóg módon kezeljük, azzal a különbséggel, hogy a körülbelül 2 x 106 sejtet tartalmazó minta térfogata: H125 pl volt. A sejtek számát és a teszt-nukleinsavak számát külön üvegcsében határoztuk meg, úgy hogy a sejt minta, a megfelelő detektor szonda, a befogó szonda és a hibridizációs elegy komponenseinek hozzáadása után a végtérfogat 200 pl volt. Kontroll kísérleteket is végeztünk, amelykeben sejt-standard-, illetve teszt-DNS-t nem alkalmaztunk. A hibridizációt, a hibridek rögzítését, a mosást és mérést a 4.b. példában leírt módon végeztük. Az eredményeket a standard görbékről olvastuk le, amelyeket a 4.b. példában ismertetett módon parallelben vettünk fel. Az eredményeket a 9. táblázat mutatja. 7
