201808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározására és reagens készlet az eljárás megvalósítására
HU 201808 B nitás-pár komplementer komponense segítségével el lehessen különíteni. A teszt és a srandard szonda-párból alkalmas reagens-készlet készíthető; ebben mind a teszt, mind a standard szonda-pár lehet DNS, vagy lehet mindkettő RNS, de lehet a teszt szonda-pár DNS és a standard szonda-pár RNS vagy fordítva. Ebből következik, hogy a hibridizációt megelőző, illetve a hibridizálás alatti körülményeket a tesztben használt szonda-pároknak megfelelően kell megválasztani. A jelen találmány szerinti eljárás főként sejtes homogenizátumokból származó nukleinsav-molekulák számának közvetlen meghatározására alkalmas, de természetesen tisztított vagy tiszta nukleinsavak meghatározására is használható. Mielőtt azonban a találmány szerinti eljárást alkalmaznánk, megfelelő előkezelési módot kell az adott nukleinsav-mintához kiválasztani. A találmány szerinti eljárással mind a DNS, mind az RNS meghatározása lefolytatható. Szükség esetén a dezoxi-ribonukleinsavakat egyszálúvá denaturáljuk. A hibridizációs tesztet az egyszálú hírvivő RNS-molekulák esetleg zavarhatják; ezeket például alkálikus közegben történő forralással elhidrolizálhatjuk. Ribonukleinsav meghatározásakor viszont a mintát nem kell denaturálni, mert a duplaszálú DNS nem zavarja az RNS meghatározást. Természetesen a DNS dezoxi-ribonukleázzal feldarabolható, vagy vegyi, vagy mechanikus úton úgy módosítható, hog a hibridizációban ne vegyen részt. Tehát a DNS és RNS meghatározásnál adott esetben egy további lépést keÖ beiktatni vagy elhagyni. Ennek az esetleges lépésnek a megválasztásánál azonban figyelembe kell venni, hogy a nukleinsav minta előkezelése hogyan történt. A szakirodalom számos előkezelési módot és olyan esetleges további kezelési lépést ismertet, amelyek alapján a legalkalmasabb módszer kiválasztható. Ha mind a teszt és mind a standard nukleinsavak DNS-, illetve RNS-típusúak, akkor a meghatározás egyetlen osztatlan mintából végezhető el. Ha a teszt-nukleinsavak DNS-, és a standard nukleinsavak RNS-jellegűek, vagy fordítva, akkor a meghatározást osztott mintában kell végezni, mert bizonyos kezelési lépések különbözők. Természetesen a minta akkor is osztható, ha mind a teszt- és mind a standard nukleinsavak azonos típusúak. A hibridizációt úgy hajtjuk végre, hogy az osztatlan minta oldatát legalább egy teszt szonda-párral és legalább egy standard szonda-párral egyidejűleg hozzuk érintkezébe. Ha a minta oldatát elosztjuk, akkor az egyik oldat-részletet legalább egy teszt szonda-párral, a másik oldat-részletet legalább egy standard szonda-párral külön-külön hozzuk érintkezébe. Az utóbbi esetben a teszt-nukleinsavat az egyik, a standard-nukleinsavat a másik reakcióedénybe határozzuk meg kvantitative. Függetlenül attól, hogy osztott mintával dolgozunk-e vagy sem, a hibridizációt mindig a legelőnyösebb körülmények között folytatjuk le. A reakció lejátszódása után a hibridizációs elegyből a kapott teszt- és standard hibrideket valamely hordozó segítségével szétválasztjuk és mossuk, vagy az elegyből a hibrideket az affinitás-pár komplemen3 tér tagjával párosítva izoláljuk. A teszt és standard hibrid jelzőanyag tartalmát megmérjük és az eredményt a standard próbákkal felvett görbéről leolvassuk. Ily módon egy adott egységben a tanulmányozni kívánt nukleinsavak száma meghatározható. A fentiek alapján a találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a) a mintában jelenlevő nukleinsavakat adott esetben hibridizációs reakcióba vihető formába hozzuk, és adott esetben a nukleinsavakat, amelyek a hibridizációs reakciót zavarhatják, olyan formában hozzuk, hogy a hibridizációs tesztben az ezekkel való interferencia kizárt legyen, b) osztatlan vagy adott esetben osztott mintában legalább egy olyan - szendvics- vagy oldatos hibridizációra alkalmas - teszt-szondapárral hozzuk érintkezésbe, amelynek nukleinsavjai eléggé homológok a mintában várhatólag nagy kópiaszámban jelenlevő nukleinsawal, érintkeztetjük továbbá legalább egy olyan, szendvics vagy oldatos hibridizációhoz alkalmasan megválasztott standard szondapárral, amelynek nukleinsavjai eléggé homológok a mintában konstans számban jelenlevő nukleinsav molekulákkal, c) a hibridizációs reakció(k) lezajlása után a teszt-hibridet és a standard hibridet elválasztjuk és adott esetben a jelzőanyag mennyiségét megmérjük, majd az adott egységben levő nukleinsav molekulák számát a teszt nukleinsavak és a standard nukleinsavak számának összehasonlítása útján meghatározzuk. A találmány szerinti eljárás főként a rák bizonyos típusainak kimutatására diagnosztikai értékű, így például a kissejtes tüdőkarcinóma gyakran a c-myc gén amplifikációjával jár együtt, azaz ennek a génnek a megnyilvánulási szintje magasabb, mint normális szövetek esetében. Neuroblasztomás eseteknél az N-myc gén amplifikációja mérhető. A találmány szerinti eljárás bizonyos szerek mutagén vagy karcinogén hatásának kimutatására, valamint gyógyszerrezisztencia kifejlődésének detektálására is alkalmas. Ismeretes például, hogy a külső beavatkozással kiváltott szelekció bizonyos gének fokozott kifejeződését eredményezi. Rák kezelésekor az adott gyógyszerrel szemben rezisztencia expressziós terméke a gyógyszert inaktiválja. Ilyen például a methotrexate, amely a dihidrofolát-reduktázért felelős gén amplifikációját idézi elő. A génamplifikáció egy másik ismert példája a metallotioninért felelős gén amplifikációja kadmium hatására. A génexpresszió mértéke a sejtműködés és afenotípus szempontjából jelentős és oly módon vizsgálható, hogy a hírvivő RNS mennyiségét mérjük, amely érték korrelációban van az általa kódol fehérje mennyiségével. Egy adott onkogén expressziós szintje a sejt típusától és differenciálódásának mértékétől, valamint a sejt fejlődési fázisától függően változhat. így például a c-myc onkogén az embrionális fejlődés bizonyos szakaszában gyorsa, egy másik fejlődési stádiumban lassan másolódik. Az amplifikáció mértéke gyakran korrelációban van e gén exp-4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
