201808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározására és reagens készlet az eljárás megvalósítására
HU 201808 B ressziós szintjével, bár az utóbbi szignifikánsan fokozódhat, anélkül, hogy az amplifikáció változna. Ilyen esetben az onkogén szerepét helyesebb az expressziós szint, mint a kópaszám alapján meghatározni. Bizonyos esetekben egyszerűbb az mRNS, mint a géntermék kvantitatív meghatározása. Erre példa a c-myc onkogén, amely egy labilis, hő hatására könnyen koaguláló protein. A találmány szerinti eljárással kromoszómaszám rendellenességek, így például a Down-kór is azonosítható. A születés előtti diagnosztizálására példa, hogy kimutatható az olyan magzati defektus, amikor a magzat valamely recesszív génre homozigóta. A találmány szerinti eljárás és az eljárásban alkalmazott nukleinsav reagenseket közelebbről a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa Onkogén amplifikációjának meghatározása a) Nukleinsavreagensek és ezek előállítása Standard szondák Sejt-standard nukleinsav A c-Ki-rasI gén minden emberi sejtben előfordul. A szendvics hibridizációhoz szükséges szondapárokat a c-Ki-rasI gén 3,8 kilobázis hosszúságú HindlII fragmensének szukbklónozásával állítottuk elő. A vonatkozó restrikciós térképet Chang és munkatársai [PNAS 19,48484-4852 (1982)] írták le. A fragmense pBR322 plazmidba klónozva például az ATCC-től kérhető ki (ATCC 41032). A sejt-standard nukleinsav további kezelése A fenü leírt pBR 322 kiónt BglII és HindlII restrikciós enzimekkel kezeljük és a kapott firagmenseket agarózgélről izoláljuk. Két, egymáshoz közel elhelyezkedő fragmenst két alkalmas vektorba klónoztunk a detektor-szondák és a befogó szondák előállítása céljából. Standard detektor szonda Egy körülbelül 1,1 kilobázis hosszúságú BglIIBglII-fragmenst pBR 322 plazmidba klónoztunk a BamHI restrikciós enzimmel hasítható klónozó helyen és nick-transzlációval 125I-jelzett dCTP-vel (dezoxicitidinfoszfát) jelöltük. Standard befogó szonda Egy körülbelül 0,5 kilobázis hosszúságú BglIIH in dl II fragmenst az M13 mplO és mpll fág-vektorokba a BamHI és HindlII enzimekkel hasítható helyek közé klónozunk, és a kapott objektumot nitrocellulóz filteren rögzítjük (150 ng DNS/1 cm átmérő). Teszt szondák Teszt nukleinsav A szendvics hibridizációhoz szükséges valamely szonda-párt egy klónozott c-myc génből állítottuk elő. Ezt a gént például az ATCC-től lehet kikérni (ATCC 41010) és a gén restrikciós térképét Watt és munkatársai [PNAS 80,6307-6311 (1983)] írták le. 5 A teszt nukleinsav további kezelése A c-myc gént HindlII, Xbal és PstI restrikciós enzimekkel kezeljük, a fragmenseket agarózgélről izoláljuk, tisztítjuk és alkalmas vektorokba klónozzuk detektor- és befogó-szondák előállítása céljából. Teszt detektor szonda A c-myc gén HindlII-Xbal enzimekkel előállított 3,7 kilobázis hosszúságú restrikciós fragmensnek egyszálú végeit DNS-polimerázzal kettős szálúvá alakítjuk. A kapott, ragadós végeket nem tartalmazó DNS-fragmensekbe T4 fág-DNS-ligáz segítségével HindlII linkereket építünk be; a DNS-t fenolos extrakció után HindlII restrikciós enzimmel kezeljük. A kapott DNS-fragmenst pBR 322 plazmidba klónozzuk a HndlII restrikciós enzimmel hasítható helyen, majd nick-transzlációval 1Ä>I- jelzett dCTP-vei jelöljük. Teszt befogó szonda A c-myc gén 1,1 kilobázis hosszúságú Xbal-PstI fragmensét az M13 mplO és mpll fág klórnozó vektorokba klónozzuk az Xbal és PstI restrikciós enzimekkel hasítható hasító helyek közé, és a kapott szondát nitrocellulóz szűrőn rögzítjük (150 ng DNS/1 cm átmérő). b) A standard görbe meghatározása A standard görbét a c-myc gén alkálikusan denaturált pBR 322 kiónját tartalmazó minta segítségével vettük fel. A szendvics hibridizációs oldathoz hozzáadtuk a fenti teszt szondákat, s ezen kívül 4 x SSC, 1 x Denhardt oldat, 200 p,g/ml hering sperma eredetű DNS és 0,2% nátrium-dodecil-szulfát volt az oldatban. A hibridizáció 65 °C-on 17-19 órát vett igénybe, ezután a szűrőket mosóoldattal (0,1 x SSC és 0,2% nátrium-dodecil-szulfát) 50 °C-on mostuk. A szendvics-hibridekbe beépült jelzőanyag mennyiségét gamma-számlálóval határoztuk meg. Az eredményt a következő 1. táblázat mutatja. 1. táblázat 6 A mintából származó molekulák száma/teszt beütésszám c-myc-filter 0 40 106 75 5xl06 190 107 340 108 2200 c) A gének számának meghatározása A minták egyrésze humán placentasejteket, más része C010 320 sejteket tartalmazott. Az utóbbiak például az ATCC-től kérhetők ki (ATCCCCC220). Mindkét mintából DNS-t izoláltunk, és az egyes tesztekben alkalikus forralással denturált azonos mennyiségű sejtes DNS-t alkalmaztunk. Az alkalikus denaturálás során a mintában levő RNS teljes mennyisége elhidrolizál. Az egyes mintákhoz c-myc és c-Ki-rasI filtert, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
