201808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározására és reagens készlet az eljárás megvalósítására
HU 201808 B A találmány tárgya eljárás bizonyos nukleinsav molekulák mennyiségének, főként a génmegsokszorozódás és/vagy a megfelelő hírvivő RNS molekulák felszaporodása mértékének a szendvicsmódszer vagy az oldatos hibridizáció alkalmazása útján történő meghatározására. Az alkalmazott reagens-készlet is a találmány tárgyához tartozik. Egy adott genomon belül az egyes gének kópiaszáma rendszerint állandó. Bizonyos esetekben egy haploid genom csak egy, máskor több gént tartalmaz. Bizonyos körülmények között a kópiaszám változhat. Génamplifikációs eseteket például rák kialakulása során észleltek. Ismeretes, hogy génamplifikáció külső tényezők (gyógyszerek, fémek) hatására is előfordulhat. A betegség kialakulásában a hibás vagy fokozott gén-kifejeződés, például az onkogén fokozott termelődése, azaz a hírvivő RNS mennyisége a sejtben, fontos szerepet játszhat. Egyes örökletes betegségek és zavarok oka bizonyos kromoszómák számának megnövekedése, más örökletes betesgégek egyetlen recesszív gén megduplázódásával járnak együtt. Minden ilyen esetben fontos a jelenlevő kromoszómák vagy gének számának meghatározása. Egyes DNS-molekulák számát, például adott gének amplifikációjának mértékét jelenleg a tanulmányozni kívánt extrahált DNS emésztésével úgy határozzák meg, hogy az emésztést restrikciós enzimekkel végzik és a kapott nukleotid-fragmenseket azok hossza szerint agarózgél-elektroforézissel elválasztják. Ezután az egyszálú DNS-t nitrocellulóz szűrőre itatják át és rögzítik, ahol is a tanulmányozni kívánt génnel vagy génrészlettel, mint szondával, hibridizáció játszódik le és az eredményt autoradiográfiás módszerrel értékelik [Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503-517 (1975)]. Az egyes parallel elemzéseknél a sejtes DNS mennyisége azonos. A hibridizációs sávok, azaz ezek jelzései intenzitását összehasonlító módszerrel vizsgálják és a vizsgált mintákban levő gének kópiaszámát visszakövetkeztetéssel állapítják meg. A módszerrel csak közelítő eredményt kapnak. Hasonlóképpen az RNS mennyiségét itatóspapíron hibridizálással (úgynevezett Northern-, vagy dot-blottin módszerrel) értékelik; ezeknek a módszereknek a pontossága azonban nem kielégítő [Thomas: Methods in Enzymol., 100,255-266 (1983)]. Az ismert Southern-féle eljárás és a Northemhibridizálás itatóspapíron (northern blotting) azonban lassú és nehézkes módszerek. Tekintve, hogy csak közelítő pontosságú eredményt adnak, diagnosztikai értékük minden olyan esetben kétséges, ha egy adott egységen, például egy sejten belül egy adott nuklainsav-molekula pontos számát kívánjuk meghatározni. A 4 486 539 számú amerikai egyesült államokbeli és a 2 169 403 számú nagy-britanniai szabadalmi lírásokban ismertetett szendvics- vagy oldószeres hibridizációs módszerek kvantitatívak annyiban, hogy lehetővé teszik a vizsgált nukleinsavak mintánkénti mennyiségének meghatározását [Virtanen és munkatársai: Lancet 1, 381-383 (1983)], nem mutatják azonban a mintában levő sejtek számát, és így nem megfelelőek az amplifikáció mértékének meghatározására. A jelen találmány szerinti eljáráshoz 1 ezért az ilyen módszeren túlmenően állandó kópiaszám standard nukleinsav is szükséges, hogy egy adott egységen (például sejten, sejtmagon, riboszómán vagy kromoszómán) belül a releváns nukleinsavmolekulák számát meg lehessen határozni. A jelen találmány célja gyors és pontos kvantitatív módszer kidolgozása nukleinsavmolekulák számának meghatározására, amely módszer gyorsabb és egyszerűbben végrehajtható a jelenleg használatosnál. Az eljárást rákos megbetegedések, születés előtti állapotok diagnosztizálására, génamplifikációt okozó ágensek kimutatására, gyógyszer-rezisztencia kialakulásának megállapítására és a hírvivő RNS (messenger RNA) expressziós szintjének meghatározására használhatjuk. A jelen találmány szerinti eljárás legalább két meghatározást tesz szükségessé. Az egyik a teszt nukleinsav meghatározása, amely nukleinsavmolekula nagy kópiaszámban lehet jelen. A másik a standard nukleinsav meghatározása, amely konstitutív nukleinsavmolekula előnyösen konstans számban van jelen. A leírásban a „nukleinsavmolekula” kifejezést 10-12 nukleotidból álló nukleotidszekvenciák, néhány ezer nukleotidot tartalmazó gének, a hírvivő RNS, vagy az egy génnél hosszabb nukleotid szekvenciák (azaz egy amplikon) megjelölésére használjuk. A teszt- és standard nukleinsavak meghatározását az egyébként ismert szendvics hibridizációs módszerek valamelyikével (például a 4486 539 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi lírás szerint) vagy a 2 169 403 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett oldószeres hibridizációs módszerrel végezhetjük. A legalább egy standrad szonda-párt és legalább egy teszt szondaoárt tartalmazó nukleinsav-reagenssel működő reagens-készletek (kit-ek) is a találmány tárgyához tartoznak. Az eljárásban használt reagenseket és szondákat a teszt-, illetve standard nukleinsavakkal kellő homológiát mutató nukleinsavakból rekombináns DNS-echnikával állíthatjuk elő. A megfelelően homológ nukleinsavakat szintetikusan vagy félszintetikusan is előállíthatjuk. A teszt és srandard nukleinsavakat közvetlenül sejtekből izolálhatjuk és különböző hibridizációs módszerekkel azonosíthatjuk. Ilyen teszt és srandard nukleinsavak egyébként már forgalomban is vannak és gén-bankokban is hozzáférhetők. A teszt és standard nukleinsavak akár DNS, akár RNS-jellegűek lehetnek. A szendvics- vagy oldószeres hibridizációhoz alkalmazható szonda-párokat rekombináns DNS- technikával álhtjuk elő a teszt- és standard nukleinsavakkal megfelelő homogenitást mutató nukleinsavakból. A releváns nukelinsavakat megfelelő restrikciós enzimekkel emésztjük; a kapott, egymáshoz közel levő restrikciós fragmentumokból legalább kettőt klónozunk legalább két alkalmas vektorral. A fragmentumok közül az egyiket (a jelző szondát) alkalmas jelzőaanyaggal jelöljük, a másikat (a befogó szondát) pedig vagy alkalmas hordozón fixáljuk, vagy egy olyan anyaghoz kapcsoljuk, amely lehetővé teszi, hogy a hibridizációs elegyből a kapott hibridet egy másik anyag, péládul az affi2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
