201806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás géntechnológiai uton módosított mikroorganizmusok által termelt tisztított növekedési hormon kinyerésére
HU 201806 B 10 mmól/liter végső koncentrációig. Az oldatot 30 percig állni hagyjuk, majd ultrahangos kezelésnek vetjük alá Heat Systems 370 wattos modell berendezésen át, 65% erősséggel. A betáplálási sebesség az ultrahangos berendezésbe 18 liter/óra. Ha az oldat nagyon homályos, centrifugáljuk 30 liter/órával CEPA101 berendezésben, egyébként az oldatot 5 literes adagokban egyedi Büchner-tölcsérekben szűrjük három 24 cm-es átmérőjű Whatman 2 papíron át. A vákuumot úgy állítjuk be, hogy megakadályozzuk a habképződést a szűrés folyamán. Az oldhatatlan anyag csak nyomokban található. A szűrlet (32,61) tartalmazza a bGH-t oldatban. A derített oldat abszorbanciája 9,1 OD 280 nmnél (l*"1 sejt). Ha az összes abszorpció a bGH-nak lenne tulajdonítható, (ami nem így van), ez 14,3 g bGH/liternek felelne meg. A valódi bGH tartalom kevesebb, mint fele ennek az értéknek. Az UV-t abszorbeáló tisztátalanságok felelősek ezért a különbségért. 1,0 abszorbancia értékét 280 nm-nél [l"““ sejt] 1,57 g/1 tiszta bGH oldat ad pH 9 értéknél (a bGH abszorbanciája változik a pH értékkel). Oldó puffer (1 mól/liter nátrium-borát, pH 11,8): 61,8 gramm bórsavat feloldunk 750 ml vízben és az oldatot pH 11,8-ra állítjuk be 50%-os NaOH oldattal. 11 végső térfogatra hígítjuk ionmentesített vízzel. Mérési módszerek: Mennyiségi gél-letapogatás a mosott üledékből és a feloldott bGH-ból A lépés kitermelése: 100%. Összesített kitermelés: 85,6% Kimenő térfogat: a kiindulási sejtszuszpenziótérfogat 6,8%-a Simított vizsgálat: 6,2 g bGH/liter Dúsított tényező: 0,039 10. PÉLDA 100K ultraszűrés 13 A derített fehérje-oldatot (32,6 liter, 2 97000 OD) (9. példa) külön adagokra osztjuk (6 x 5,4 liter), amelyek mindegyikének abszorbanciája 50000-60000 OD. Minden adagot külön vetünk alá 5 ultraszűrésnek Pellicon Cassette System ultraszűrőn át (Millipore, Bedford, Massachussets, Amerikai Egyesült Államok), amely három, 100000 molekulatömeg kizárásos kazettával (PTHK típus) van felszerelve, ezek mindegyike kb. 0,46 m2 területű. 10 Az első adagot 1 liter visszamaradó anyag térfogatra koncentráljuk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük, UV-val megmérjük és megőrizzük. A visszamaradó anyagot eredeti térfogatára hígítjuk vissza friss 10 mmól/literes nátrium-borát pufferral (pH 15 11,8), és alaposan összekeverjük. A keveréket ismét 1 liter visszamaradó anyag térfogatra koncentráljuk. Az ultraszűrletet összegyűtjük és egyesítjük az első utraszűrlettel. Amikor az OD abszorbancia aktuális értéke egyenlővé válik az ultraszűréshez 20 adott kiindulási adag OD abszorbancia értékének 20%-ával, a visszamaradó térfogatot a következő koncentrálásnál 0,5 literre vesszük 1 liter helyett. A koncentrálás és a 10 mmól/liter nátrium-boráttal való hígítás ciklusát addig folytatjuk, amíg a 0,5 liter 25 visszamaradó anyagból való ultraszűrlet 280 nm-nél (l'cm sejt) mért abszorbanciája kevesebb lesz, mint 0,1. Ez normális esetben 9 és 12 közti ultraszűrést és hígítást tesz ki. A végső visszamaradó anyagot elöntjük. Az ultraszűréshez alkalmazott áramlási 30 sebességeket az 1. Táblázatban mutatjuk be. Ezután az összes ultraszűrleteket egyesítjük és pH 9,0-ra állítjuk be 6 n HCl oldattal. A többi 5,4 literes adagot is átvisszük a Pellicon System-en hasonló módon, és az összes pH-ra beállított ultra- 35 szűrletet egyesítjük. Egy tipikus lefutás 380 liter ultraszűrletet termel 0,26 OD/ml abszorbanciával, amely egyenértékű 100000 teljes OD értékkel (pH 12), és 24-40 órát igényel, hogy teljesen végbemenjen. 40 14 1. Táblázat Áramlási sebességek 100K molekulatömeg ultraszűréhez1 Körülmények Sebesség egységnyi membránterületre Sebesség 3 kazettánál 1,40 m2 Ultraszűrési sebesség, amikor a 241/óra visszamaradó anyag a legkoncentráltabb 17,221/óra m2 Ultraszűrési sebesség, amikor a 361/óra visszamaradó anyag a leghígabb 25,811/óra m2 Visszacirkulálási sebesség, amikor 181/perc a visszamaradó anyag a legkoncentráltabb 775,001/óra m2 Visszacirkulálási sebesség, amikor 91/perc a visszamaradó anyag a leghígabb 387,501/óra m2 Megjegyzés:1440 KPa bemenő és 134 kPa ellennyomásnál Mérési módszerek: Mennyiségi gél letapogatás a bemenő anyagból és abszorbancia 280 nm-nél 60 (l’cm sejt) a kimenő anyagból; minőségi gél-kromatográfia. A lépés kitermelése: 75,5% Összesített kitermelés: 64,6% Kimenő térfogat: a kiindulási sejtszuszpenzió- 65 térfogat 76%-a. Számított vizsgálat: 0,4 g bGH/liter Dúsítási tényező: 0,065 A betáplált anyag, a visszamaradó anyag és az ultraszűrlet mindegyikét Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok) gél-kromatográfiával 8
