201806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás géntechnológiai uton módosított mikroorganizmusok által termelt tisztított növekedési hormon kinyerésére
HU 201806 B vizsgáljuk meg abból a célból, hogy meghatározzuk az elkülönítés mértékét és minőségét. A gél-oszlop körülményei a követőkezők: 2,6 cm átmérő x 100 cm hossz Teljes térfogat: 500 ml. Kitöltetlen térfogat: 150 ml Áramlási sebesség: 40-60 ml/óra Terhelés: 50 OD 5 ml-ben Eluálószer: 10 mmól/literes nátrium-borát, pH 12 Normális futási idő: 5 óra Kimutatás: UV (280 nm) Gél-kromatográfiás puffer (10 mmól nátriumborát oldat, pH 12): Készítését lást leírva a 9. példában. 11. PÉLDA Ioncserélő kromatográfia A 10. példa szerinti 100K ultraszűrésből nyert egyesített ultraszűrleteket (380 liter, 100000 OD abszorbanciával) Sepharose CL-6B DEAE ioncserélő oszlopra visszük (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok) 93 cm/óra lineáris áramlási sebességgel (100 liter/óra). A 37 cm átmérőjű, 15 cm magas oszlopot két ágytérfogat (32 liter) 10 mmól/literes nátrium-borát oldattal (pH 9) mossuk, és a ráterhelési és mosási lépésekből származó eluátumokat elöntjük. Az eluálószert 10 mmól/liter nátrium-borát + 100 mmól/liter nátrium-kloridra (pH 9) cseréljük, ez kiszorítja a bGH-t az oszlopból. Az eluálási áramlási sebesség 93 cm/óra. Az eluálás előrehaladását az eluátum 280 nm-nél mért abszorbanciájának követésével figyeljük. A bGH csúcsot a 4-5 ágytérfogatban gyűjtjük össze (84 liter, 43000 ÓD teljes abszorbanciával) és megőrizzük. A bGH frakció átlagos koncentrációja 0,8 g bGH/liter. Az oszlopot az ágy mosásával regeneráljuk 93 cm/óra sebességnél a következőképpen: egy ágytérfogat 1 mól/literes nátrium-acetát oldatot, amelyet pH 3,0-ra állítunk be HCl-el visszük fel az oszlopra, amelyet másfél ágytérfogat 0,5 n NaOH követ. Az NaOH-val végzett kezelés után az oszlopot állni hagyjuk két órán át, amely idő után az oszlopot másfél ágytérfogat 1 mól/literes, HCl-vel pH 3,0-ra beállított nátrium-acetát oldattal mossuk. Az ágyat azután kiegyensúlyozzuk 10 mmól/literes nátrium-boráttal (pH 9), legalább három térfogat puffert futtatva át az ioncserélő ágyon keresztül. Az eluátum vezetőképességét és pH-ját ellenőrizni kell a bemenő oldattal szemben. Mérési módszerek: Abszorbanda 280 nm-nél (1-°“ sejt) A lépés kitermelése: 43%. Összesített kitermelés: 27,7% Kimenő térfogat: az eredeti sejtszuszpenzió térfogatának 16,8%-a 15 Számított vizsgálat: 0,8 g bGH/liter Dúsítási tényező: 2 Oszlopmosó puffer (10 mmól/liter nátrium-borát, pH 9): 0,62 g bórsav 750 ml ionmentes vízben készített oldatát pH 10-re állítjuk be tömény sósavval, 11-re hígítjuk ionmentesített vízzel, és ha szükséges, újból beállítjuk pH 9,0-ra. Eluáló puffer (10 mmól/liter nátrium-klorid, pH 9): 3,81 g nátrium-borát dekahidrát és 5,85 g nátnum-klorid 750 ml ionmentesített vízben készített oldatát pH 9,0-ra állítjuk be tömény sósavval, majd 1 literre hintjük ionmentesített vízzel, és ha szükséges, újból beállítjuk pH 9,0-ra. Regeneráló puffer (1 mól/liter nátrium-acetát, pH 3,0): 136,09 g nátrium-acetát 3H2Ö 750 ml ionmentesített vízben készült oldatát pH 3,0-ra állítjuk be tömény sósavval, 1 literre hígítjuk ionmentesített vízzel, és ha szükséges, újból beállítjuk pH 3,0-ra. 12. PÉLDA Koncentrálás és dialízis Az ioncserélési lépésből nyert (11. példa) bGH frakdót (84 liter, 43000 OD) pH 10,5-re állítjuk be 1 n NaOH-val. A beállított oldatot ultraszűréssel koncentráljuk Millipore Pellicon ultraszűrőn át, amely fel van szerelve három, 0,46 m2 területű 10000 molekulatömeg kizárásos kazettával (TGC típus), a koncentrálást addig végezve, amíg a visszamaradó anyag számított abszorbanciája 280 nm-nél (l<m sejt) 10 lesz. Az ultraszűrlet nem tartalmazhat bGH-t, így eldobjuk. A visszamaradó anyagot általában durván 20 faktorral koncentráljuk (4,2 liter visszamaradó anyag). Az áramlási sebességeket a 2. Táblázat mutatja be. Miután a bGH-t koncentráltuk, az oldatot sómentesítjük NH40H-val szemben végzett dialízissel, Pellicon System berendezést alkalmazva 10K molekulatömeg kizárásos kazettával (diaszűrés). 3 mmól/liter NH4OH oldatot (25 térfogat/visszamaradó anyag térfogat; vagy jelen esetben 105 liter 3 mmól/literes NH4OH oldat) adunk folyamatosan a visszamaradó anyaghoz olyan sebességgel, amely elegendő, hogy pótolja a diaszűrés miatt előálló térfogati veszteséget. A diaszűrletet azután eldobjuk. Ez sókat tartalmaz és a bemenő bGH 10%-át, amint ezt abszorbandával mérjük. A sómentesített bGH-t tartalmazó visszamaradó anyagot kiürítjük a Pellicon System berendezésből, és az ultraszűrőt kis mennyiségű 3 mmól/literes NHtOH-val mossuk, a mosófolyadékot a visszamaradó anyaggal egyesítjük. A visszamaradó térfogat a mosófolyadék hozzáadása előtt 4,2 liter (39000 OD), 14,6 g bGH/liter koncentrációval. Az áramlási sebességeket a 3. Táblázat mutatja be. 16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9
