201806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás géntechnológiai uton módosított mikroorganizmusok által termelt tisztított növekedési hormon kinyerésére
HU 201806 B újra koncentrálást. Egy másik módszer szerint az ultraszűrést végre lehet hajtani egyszer vagy többször lényegében konstans visszamaradt térfogatnál. Egy különösen előnyös kiviteli módban az ultraszűrést addig ismételjük, amíg a visszamaradt anyag 280 nanométernél mért abszorbandája kevesebb lesz, mint 0,1 optikai sűrűség-egység. A hormont az ultraszűrletből olyan tisztasággal és biológiai aktivitással nyerjük, amely lényegesen jobb, mint a korábban gélkromatográfiával elért érték. Az ultraszűréssel nyert tisztított hormont vagy analógot azután pl. ioncserélő kromatográfiával, ezen belül pl. amin-tartalmú ioncserélő gyantákkal, mint pl. dietil-amino-etil gyantával nyerjük ki. Kívánt esetben az ioncserélő kromatográfia előtt az ultraszűrletet 10K molekulatömeg kizáró membránnal koncentráljuk. Az ioncserélő kromatografálási lépés során a hormontól vagy analógjától elkülönítjük a megmaradó DNS-t, lizozimot (ha van jelen) és a multimereket. Ebben a lépésben az ultraszűrlet pH-ját először a megfelelő pH-ra, pl. 9-re állítjuk be sósavas titrálással, és megfelelő ioncserélő oszlopra, pl. DEAE-Sepharose CL-óB (gyorsáramlású) KS-370 többtagú oszlopra (Pharmada Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok) visszük fel. A rendszert azután megfelelő pufferral pl. 10 mmól/literes borát-pufferral mossuk és a mintát megfelelő sebességgel, alkalmas eluálószerrel, pl. 100 mmól/liter NaCl-t tartalmazó 10 mmól/literes burát-pufferral (pH 9), eluáljuk. A hormont vagy analógot tartalmazó frakciókat ultraszűréssel lehet koncentrálni pl. 10K molekulatömeg kizárású Pellicon Cassette vagy PUF- 100 spirál berendezés segítségével, majd lehet dializálni egy alkalmas só megfelelő koncentrádóját tartalmazó oldattal, pl. 3 mmól/liter ammóniumhidroxiddal vagy ammónium-hidrogén-karbonáttal szemben, ismét 10K molekulatömeg kizárási Pellicon Cassette berendezést alkalmazva. A dializált anyagot azután liofilezéssel vagy megfelelő körülmények között végzett porlasztva szárítással lehet szárítani. A porlasztva szárítás a gazdaságosabb módszer és ez kényelmegesen végre lehet hajtani egy kisebb porlasztva szárító berendezésben (Niro Atomiter), kb. 200 #C belépő és kb. 50 °C kilépő hőmérsékletet és kb. 2,5 liter/óra áramlási sebességet alkalmazva. Afenti módon tisztított állati növekedési hormonokat vagy analógokat így fehér, finom por formájában nyerhetjük ki. A tisztított állati növekedési hormonokat vagy analógokat ezzel a módszerrel 30% vagy nagyobb kitermeléssel nyerhetjük ki a fermentádó végén a baktériumokban jelen levő hormon vagy analóg tömegére vonatkoztatva. Az így nyert hormon vagy analóg 15%-os poliakrilamid-SDS (nátrium-dodecil-szulfát) gélen fejlesztjük ki kis molekulasúlyú markerekkel (Pharmada) mint referencia-anyagokkal szemben kifejlesztve egyetlen foltként jelenbe meg. A találmány szerinti ejárással ultraszűrés és ioncserélő kromatográfia után nyert peptidek tisztábbak és stabilabbak, mint amikor gél-kromatográfiás alkalmaznak ultraszűrés helyett, vagy mint amikor a peptidek koncentrálását 10K molekulatömeg kizárású ultraszűréssel végzik el ioncserélő kroma-7 tográfia helyett. A kinyert hormonok vagy analógok biológiai aktivitása tekintetében a radioimminassay eredmények azt jelzik, hogy a természetes hormon elleni antitesteknek kb. azonos az affinitása az alkalmas mikroorganizmus által termelt és a találmány szerinti eljárással kinyert hormonhoz vagy analóghoz. Hasonlóképpen a radioreceptor kötési vizsgálatok azt jelzik, hogy a megfelelő membránok kötési aktivitása a találmány szerinti eljárással tisztított hormonok vagy analógok irányában egyenértékű a természetes hormonok autentikus mintái irányában mutatott aktivitással. Ezen túl, a hormonokra vagy analógokra antitestek nem mutathatók ki a peptidek megfelelő állatokba történt sem első, sem emlékeztető oltását követően. Ezen túl a szarvasmarha növekedési hormonról úgy találjuk, hogy növeli a tejképződést, amikor tejelő tehenekbe adjuk be. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük, az oltalmi kör korlátozásának szándéka nélkül. 1. PÉLDA Az E. coli növesztési és egy bGH analóg előállítása I. Törzstenyészetek Az E. coli ATCC 39806 törzs, amely a növesztés és indukdó után a Met-Asp-Gln-bGH analógot termeli, törzstenyészeteit kazeines tápközegben tenyésztjük (lásd azlnokulum c. fejezetet), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza: 8 K2HPO4 6,3 g KH2PO4 1,8 g Na-dtrát 0,45 g MgS04.7H20 0,09 g (NH4)2S04 0,9 g Glicerin 44,0 g II. Inokulum Az inokulumot 20 g/1 kazein hidrolizátumot, 10 g/liter élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó tápközegben szaporítjuk. Rázólombikban elhelyezett steril tápközeget inokulálunk törzstenyészettel, és 15 órán át rázógépen, kb. 200 fordulat/perccel rázva 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Szükség szerint az inokulum szaporításban az ezt követő lépéseket kevert, levegőztetett fermentorban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulumtenyészettel inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH ± 0,5 értéknél keverés és levegőztetés mellett, hogy kb. 20% levegő-telítettségnek megfelelő oldott oxigén szintet tartsunk fenn. III. Termelés A termelő tápközeg a következőket tartalmazza: Kazein hidrolizátum 20 g/liter Élesztőkivonat 10 g/liter K2HPO4 2,5 g/liter MgS04.7H20 1 g/liter NaCl 5 g/liter Biotin 0,1 mg/Iiter Tiamin 1 mg/liter Nyomelem-oldat 3 ml/1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
