201806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás géntechnológiai uton módosított mikroorganizmusok által termelt tisztított növekedési hormon kinyerésére
HU 201806 B A tápközeg tartalmaz 100 mg/liter amplicillint is. Az amplicillint a termelési lépésben adott esetben az inokulum növesztéséhez használt tápközegben, azonban mindig alkalmazzuk. A biotin, a tiamin és az amplicillin tömény oldatait külön-külön szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk a steril termelő tápközeghez. Steril glükóz oldatot is adunk a kezdetnél 10 g/1 koncentráció elérésére. Az indukciós lépésnél további 10 g/l-nek megfelelő glükózt adagolunk. A nyomelem-oldat a következőket tartalmazza: 9 FeCb 16 g/liter ZnCkAFfeO 2 g/liter C0CI2.6H2O 2 g/liter Na2Mo04.2H20 2 g/liter CaCl2.2H20 1 g/liter CuCh 1 g/liter H3BO3 0,5 g/liter koncentrált sósav 100 ml/1 A tápközeget 0,5-10% inokulum-tenyészettel inokuláljuk és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A keverési-levegőztetési sebességet úgy állítjuk be, hogy 20% levegő-telítettségi szint feletti oldott oxigén-szintet tartsunk fenn. A pH-t 7,0 és 7,5 ± 0,2 között tartjuk fenn NH3-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a kb. 3,5 g/liter (ODőóo = 100) értéket, az indukciót beindítjuk a hőmérsékletet 42 6C-ra emelve. A hőmérsékletet ez után 1-5 órán át 42 °C- on tartjuk, ezután az idő után a sejteket ki lehet nyerni a sejtszuszpenzióból. 2. PÉLDA A sejtek kinyerése 500 liter, az 1. példa szerint nyert sejtszuszpenziót (amely 6,15 DCW/liter és 490 mg bGH/liter tartalmaz) szobahőmérsékletre lehűtünk és tárolótartályba viszünk át. A sejtszuszpenziót 14000 fordulat/perccel (16000 g) centrifugáljuk CEPA 101 csöves tartályú centrifugában 250 liter/óra betáplálási sebességet alkalmazva. A CEPA 101 centrifugának 73,7 cm hosszúságú csőhossza, a kiöntő gátnál 3,25 cm sugara és a tartályfalnál 7,35 cm sugara van. Ez gyorsító bordákkal van felszerelve és hűtéssel rendelkezik a külső köpenyen. A tiszta felülúszó sűrűsége 1,0 g/ml, nem tartalmaz kimutatható bGH-t, így elöntjük. Az üledék, amely 11,4 kg-ot nyom (75% nedvesség), tartalmazza az aggregálódott bGH-t, ezt kell megőrizni. Az üledék kb. 2 cm vastagságú, sűrűsége 1,1 g/ml. Egy másik eljárás szerint a sejteket egy éjszakán át, ülepedni hagyjuk, és a tiszta felülúszót leszivatjuk. Mérési módszerek: Mennyiségi gél-letapogatás a sejtszuszpenzióból, a felülúszóból és az üledékből. A lépés kitermelése: 100%. Összesített kitermelés: 100% Kimenő térfogat: a kezdeti sejtszuszpenzió-térfogat 2,3%-a Számított vizsgálat: 21,5 g bGH/lg üledék Dúsítási tényező: 44 (bGH koncentráciú a kimenő anyagban/bGH koncentráció a bemenő anyagban). A kitermelést az OD egységek mérésével határozzuk meg, amelyet úgy definiálunk, mint az oldat abszorbanciája 280 nm-nél (1 cm sejt) szorozva az oldat térfogatával ml-ben. így pl. ha az OD érték 9,1 és az oldat térfogata 32600 ml, az OD egységek értéke 297000 OD. Ha az abszorbancia leolvasás pH 9-nél történik, az OD értéket át lehet alakítani bGH grammokká beszorozva 0,00157 átalakítási tényezővel, így a kitermelés 14,3 g bGH/liter. 3. Példa A sejt szétzúzása A sejt-kinyerési lépésből (2. példa) nyert nedves sejteket (11,4 kg) 1 liter nedves sejtre számítva 4 liter, 5 mmól/1 Trisz-t és 50 mmól/liter NaCl-t tartalmazó pufferben (pH 7,4) szuszpendáljuk (vagyis összesen 45,6 literben). PoÚtron nagy nyíróerőt biztosító keverő (Kinematica) segítségével diszpergáljuk az üledéket. A szuszpendált sejteket Dynomill KD-5 golyósmalom zúzóba tápláljuk (Willy A., Bachofen, Basel) 801/óra sebességgel. A golyós őrlés közben hűtéssel -10 °C és +8 °C közti hőmérsékletet tartunk fenn. A szétzúzott sejteket azután azonos térfogatú ionmentesített vízzel hígítjuk a CEPA 101 csöves serleg-centrifugán történő centrifugálás előtt. A centrifugába a betáplálási sebesség 30-60 liter/óra. Az összes centrifugálási körülmény, a betáplálási sebesség kivételével, azonos azzal, amelyet a sejtek kinyerésénél alkalmazunk. A felülúszót, amely a bevitt bGH kb. 10%-át tartalmazza, eldobjuk. Az üledék, amely 5,28 kg-ot nyom (75% nedvesség), tartalmazza az aggregált bGH-t, ezt megőrizzük. Szétzúzási puffer (50 mmól/liter Trisz és 50 mmól/liter NaCl, pH 7,4): 6,06 g Triszt és 2,97 g NaCl-t tartalmazó oldatot (750 ml ionmentesített vízben) pH 7,4-re állítunk be koncentrált HCl-val, 1 literre hígítjuk ionmentesített vízzel, és ha szükséges, újra beállítjuk pH = 7,4- re. Mérési módszerek: Mennyiségi gél-letapogatás a sejtekből, felülúszóból és üledékből. A lépés kitermelése: 90%. Összesített kitermelés: 90% Kimenő térfogat: a kiindulási sejtszuszpenzió-térfogat 1,05%-a Számított vizsgálat: 37,1 g bGH/kg üledék Dúsítási tényező: 1,7 4. PÉLDA Lizozimes kezelés A szétzúzási lépésből (2. példa) származó nedves üledéket (5,28 kg) az eredeti, kinyert nedves sejt kilogrammjaira számítva 1,2 liter, 50 mmól/liter Trisz-t és 50 mmól/liter EDTA-t tartalmazó pufferben (pH 7,4) szuszpendáljuk (összesen 13,7 literben). Politron nagy nyíróerőt biztosító keverő segítségével diszpergáljuk az üledéket. Lizozimot (Sigma Grade II) adunk hozzá 0,05 g/liter zagy menynyiségben, és a zagyot 37 °C hőmérsékleten keverjük egy órán át. Triton X-100-at (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) adunk hozzá (100 ml 10 térf%-os, pH=7,4-re pufferolt oldat/literenként, amely 1% Triton X-100 végső koncentrációt eredményez), és a keveréket további 30 percen át inkubáljuk. A zagyot ultrahang-kezelésnek vetjük alá áramlási cellákkal ellátott Heat Systems 370 wattos ultra10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
