201805. lajstromszámú szabadalom • Eljárás UK-6 1689 antibiotikum mikrobiológiai uton történő előállítására valamint a hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 201805 B meli, a két antibiotikum aránya a tenyésztési körülményektől függően valamennyire változik. Az így kapott mutáns morfológiai tulajdonságai és tenyészetének jellemzői lényegében az itt leírt A.roseorufa ATCC 53 666 törzs tulajdonságaival azonosak. A mutáns megkülönböztető tulajdonsága, hogy olyan UK-61689 és UK-58852 keveréket képes termelni, melyben az UK-61689 a főtermék. A mutáns tenyésztésére és az UK-61689 antibiotikum kinyerésére lényegében olyan körülményeket használunk, melyeket előzőleg a poliéter típusú antibiotikumot termelő tenyészeteknél már alkalmaztak. Példaként említhetjük a 4 361649 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmat. A tenyésztést előnyösen vizes süllyesztett táptalajban végezzük aerob körülmények között 24-36 °C hőmérsékleten kevertetve. A tényészethez használt táptalaj asszimilálható szénforrást - például cukorokat, keményítőt vagy glicerint - és szerves nitrogénforrást - például kazeint, enzimmel emésztett kazeint, szójadarát, gyapotmag-darát, földimogyoró-darát, búza síkért, szójalisztet vagy hallisztet - tartalmaz. Előnyös növekedési anyagokat - például gabonakivonatot, hallisztet, gyapormag-darát, élesztőkivonatot, stb. - és ásványi sókat - például nátrium-kloridot, kalcium-karbonátot -, valamint nyomelemeket - például vas-, magnézium-, réz-, cink-, kobalt- és mangánsókat - is alkalmazni. Ha a fermentáció alatt túlzott habzás lépne fel, habzásgátlóként például növényi olajakat vagy szilikonokat adhatunk a tenyészethez. A süllyesztett tenyészet levegőztetéséhez előnyös, ha percenként a fermentlé térfogatának 0,5-2-szeresét kitevő steril levegőt buborékoltatunk át a fermentleven. A kevertetéshez a szokásosan alkalmazott keverőket használhatjuk. A kevertetés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. Rázott lombiknál a kevertetés általában percenkénti 150-300 fordulatszámmal történik, fermentornál a percenkénti fordulatszám rendszerint 300-1700. Az átoltásoknál és a kinövesztés alatt természetesen aszeptikus körülményeket kell biztosítani. Az antibiotikum-termeléshez szükséges oltóanyagot a ferdeagaron kinövesztett tenyészetből vagy a tenyészetből vagy tenyészet megnedvesített micéliumszuszpenziójával beoltott, Roux edényben készített kultúrákból nyeljük. A szilárd táptalahoz vagy a Roux edényben való tenyésztéshez ATCC 172 tápközeget használunk. A mutációs eljárásnál előzőekben említett folyékony táptalaj alkalmas a vegetatív micéliumok kinövesztéséhez, melyeket aztán majd lefagyasztunk. A tenyészettel rázott lombikot vagy inokulum-edényt olthatunk be; az anokulum-edény beoltható a rázott lombikról is. A rázott lombikokban a maximális növekedést rendszerint 4-8 nap alatt éljük el, míg süllyesztett inokulum-edényekben a legkedvezőbb idő általában 4-5 nap. A fermentáció alatt az antibiotikum-termelést vékonyrétegkromatográfiával követjük nyomon. A kromatogram kvalitatív kiértékeléséhez a lemezt vanillines reagenssel permetezzük le, amint azt az előzőekben már ismertettük. Eljárhatunk úgy is, hogy a kifejlesztett kromatogram Bacilus subtilis tesztorganizmust tartalmazó agy-szívkivonatos 3 agart rétegezőnk, és 16 órás 37 #C hőmérsékleten történő inkubálás után vizuálisan értékeljük az antibiotikumok jelenlétét. A vékonyrétegkromatográfiás analízist felhasználhatjuk a fermentléből nyert nyers vagy tisztított termék minősítésére is. A fermentlé UK-61689 termékének és UK 58 852 melléktermékének mennyiségi meghatározására HPLC módszert használunk. A kromatografálást ez esetben egy 10 cmx4,6 mm méretű „mikrobore” C-18 oszlopon végezzük, eluensként 0,01M ammónium-karbonát/acetonitril/metil-alkohol 40:200:760 arányú elegyét használva. A detektálás törésmutató-detektor segítségével történik. Az itt leírt mutánsok által termelt UK 61 689 antibiotikum a micéliumban és a tápfolyadékban halmozódik fel, vagyis a szüretien teljes fermentlé extrahálásával nyerhető ki Az extraháláshoz használt szerves oldószer lehet péládul kloroform, etilacetát, metil-izobutil-keton vagy butil-alkohol. Az extrahálást előnyös semleges kémhatásnál végezni. Hogy az emulzióképződés okozta nehézségeket elkerüljük, eljárhatunk úgy is, hogy a micéliumot előzetesen elválasztjuk, majd a micéliumot és a micéliummentes fermentlevet külön-külön extraháljuk szerves oldószerrel. Az extraktumot bepároljuk, és a betöményített oldatot kromatografáljuk. Az antibiotikum kinyerésére az alábbiakban egy konkrét tipikus példát adunk meg: A mutáns teljes fermentlevét metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Csökkentett nyomáson bepárolva az extraktumot vöröses olajat kapunk. Ezt etil-acetátban oldjuk, és szilikagéloszlopra visszük. Az oszlopra vitt anyagot etil-acetáttal eluáljuk, az eluátumot vékonyrétegkromatográfiával analizáljuk. Az UK-61689 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. A kapott terméket diizopropil-éterben kristályosítva tisztítjuk az antibiotikumot. Az antibiotikumot kinyerhetjük a micéliumhoz kötve, ha a teljes fermentlevet bepároljuk, például porlasztásos szárítással; vagy a micéliumot szűréssel vagy centrifugál ássál elválasztva, a hozzákötött és a köztitérben magával vitt antibiotikumhoz juthatunk hozzá. A fent elírt FE-28454 (ATCC 53 674) mutánsát, az egy-telep izolátum FD-28454 előállításánál ismertetett módon. Az eljárás során egy további mutáns, az FD-28499 (ATCC 53664) jelű keletkezett, mely az Actinomadura roseorufa ATCC 53 666 és természetesen az először keletkezett mutáns morfológiai tulajdonságait és tenyészetének jellemzőit mutatja. Az FD-28499 mutáns azonban különbözik az FD-28454 és FD-28474 mutánsoktól, amennyiben az UK-58852 antibiotikumtól csaknem mentes (maximum 1%) UK-61689 antibiotikumot termel. Az FD-28499 mutánst hasonló módon tenyésztjük, mint az először leírt FD-28454 mutánst, és az UK- 61689 antibiotikumot az előzőekben leírt módon nyeljük ki Ez utóbbi mutánst, mely a Pfizer Inc. töizsgyűjteményében FD-28499 azonosító jellel szerepel, az FD-28454 és FD-28474 mutánsokat, valamint a kiindulási FD-27684 mikroorganizmust a Budapesti Egyezmény feltételei között letétbe helyeztük az Amerikai Törzsgyűjteményben (American Typre Culture Collection, Rockville, Maryland, USA). 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
