201805. lajstromszámú szabadalom • Eljárás UK-6 1689 antibiotikum mikrobiológiai uton történő előállítására valamint a hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 201805 B A találmány tárgya eljárás az új UK-61689 antibiotikum mikrobiológiai úton történő előállítására. Ezt a kokddiumos fertőzés elleni, policiklusos savas étert eddig csak kémiailag lehetett előállítani. Közelebbről meghatározva, a találmány tárgya eljárás az UK-61689 antibiotikum germentatív úton történő előállítására Actinomadura roserufa ATCC 53 666 törzzsel, illetve Actinomadura roseorufa ATCC 53 665, ATCC 53 664 és ATCC 53 674 mutánstörzsekkeL Az Ep-0169011 számú európai szabadalmi bejelentés (közzétével 1986. január 22-én) leírja az ÚK- 58852 antibiotikumot. Ezt a policiklusos étert Actionomadura rosoerufa Huang, sp. nov., ATCC 39 697 törzs süllyesztett aerob tenyészetével állítják elő vizes tápközegben. Az UK-61689 monoglikon policiklusos savas étert az (I) képlet jellemzi. Előállítását a 255 335 számú európai nyilvánosságrahozatali irat (1982.02.03.) ismertet a (II) általános képlető UK-58852 digükon policiklusos éter (R, R1=H) szelektív savas hidrolízisével. Az említett szabadalmi bejelentésben leírt eljárás szerint az UK-58852 nátriumsóját ekvivalens mennyiségű ptuolulszulfonsawal hidrolizálják acetonitril/víz elegyében szobahőmérsékleten. Magának az UK-58852-nek, ennek a különösen kokddium ellenes, hatékony antibiotikiunnak az előállítását az EP-169011 számú európai szabadalom (közzétéve 1986. január 22-én) írja le. Ezt az antibiotikumot az Actinomadura roseorufa Huang sp. nov. ATCC 39 697 süllyesztett aerob tenyészetével állítják elő vizes táptalajhoz. Az UK-58852 mellett két rokonszerkezetű minor komponens is keletkezik, melyek kokddiozissal szemben hatásos antibiotikumnak bizonyultak. A két minor komponens: a (II) általános képletű CP-70228, ahol R jelentése hidrogénatom és R1 jelentése metilcsoport; illetve a CP-70828, ahol R és R1 jelentése egyaránt metilcsoport A találmány tárgya az UK-61689 antibiotikum mikrobiális előállítására, mely abból áll, hogy az Actinomadura roseorufa ATCC 53 664, 53665, 53674 vagy 53 666 törzset vizes táptalajon tenyésztjük, előnyösen süllyesztett tenyészetben, aerob körülmények között Az UK-61689 hatásos kokddium ellenes antibiotikum, kémiai szerkezetét illetően policiklusos savas éter. Különösen jelentősek az Actinomadura roseorufa ATCC 53 666 törzsből származó ATCC53 674, és az ATCC 53 665 mutánsok, melyek a61689 antibiotikum mellett UK-58852 antibiotikumot is termelnek, illetve az ATCC 53 665 egyik mutánsa, az Actinomadura roseorufa ATCC 53 664 törzs, mely lényegében UK-58852-től mentes UK-61689 antibiotikumot termel. Az UK-61689-et és az UK-58852-t termelő mikroorganizmusokat az Actionomadura roseorufa FD-27684 (ATCC 53 666) új törzs mutádójával nyertük, melyet Yamae VUlage-i (Kamamato, Japán) talajmintából izoláltak. Mutagén anyagként N-metil-N’-nitro-guanidint (NTG) használtunk. A kezelt mikroorganizmusok különálló telepeit vizsgáltuk meg az UK-61689 antibitoikum-termelés szempontjából. Az eljárás abból áll, hogy az ATCC 53 666 törzset süllyesztett tenyészetként vizes táp1 talajban tenyésztjük aerob körülmények között, 28 °C hőmérsékleten rázatva. Kinövesztéshez bármilyen alkalmas táptalajt használhatunk. A táptalaj elkészítésénél 1 liter vízhez adunk 10,0 g cerelóz-t, 5.0 g kukoricakeményftőt, 5,0 g kukoricalekvárt, 5.0 g NZ Amine YTT készítményt (enzimatikusan emésztett kazein, Humko Sheffield Chemical Co., Inc.) és 0,002 g kobalt-kloridot, nátrium-hidroxiddal a táptalaj kémhatását pH = 7,0 értékre állítjuk be, és 800 milliliterenként Fembahc edényekbe mérjük szét. Autoklávban történő sterilizálás után az edényeket ferdeagaros tenyészet szuszpenziójával vagy fagyasztva tárolt vegetatív micéliummal oltjuk be és 28 °C hőmérsékleten rázatjuk 200 fordulattal percenként 8 napon át. 50 ml kivétet teflon szövethomogenizátorban elhomogenizálunk, majd ultrahanggal fragmentálunk. A fragmentált micéliumot centrifugáljuk, a tápközegtől mentesre mossuk és 300 ml-es Erlenmeyer lombikban 50 ml friss táptalajban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót rázatással 32 9C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, majd a sejteket ismét lecentrifugáljuk és 50 ml trisz(hidroxi-metil)-amino-metán/maleát pufferben, pH = 9,0, szuszpendáljuk. A szuszpenzió megfelelő kivett mennyiségét 750-1500 mcg/ml NTG- vel kezeljük egy órán át 34 °C hőmérsékletű vízfürdőben rázatva percenként 250-300 fordulatszámmal. A mutagén kezelés után a sejteket centrifugáljuk, steril vízzel a mutagenizáló szertől mentesre mossuk, és friss táptalajt tartalmazó lombikban növesztjük 32 °C hőmérsékleten rázatva percenként 200 fordulatszám mellett. Három napos tenyésztés után a tenyészlevet homogenizáljuk és ultrahangos kezelésnek vetjük alá, majd egy kivéttel hígítási sorzatot készítünk, amit szilárd táptalajokra kenünk ki. A lemezeket 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk, amíg a különálló telepek megfelelő nagyságot nem érnek el ahhoz, hogy ferdeagarra vigyük át őket. A lemezeket és a ferdeagart ATCC 172 számú táptalajból készítjük, mely literenként 1,0 g N-Z Amin Type A komponenst (Humko Sheffiel Chemical Co., Inc.) tartalmaz. A ferdeagarral oltott tenyészetet 28 °C hőmérsékleten növesztjük ki. 10- 14 nap elteltével a tenyészetek vizsgálatra készek. Ehhez 300 milliliteres Erlenmeyer lombikokban levő 25 ml táptalajt oltunk be. Alkalmas például az alábbi összetételű táptalaj: 1 liter vízben 45,0 g cerelóz, 10,0 g szójaliszt, 15,0 g kukoricalekvár, 0,1 g mangán-szulfát-víz, 0,1 g magnézium-szulfát-7- víz, 0,002g kobalt-klorid és 3,0 g kaldum-karbonát; a táptalaj kémhatását pH=7,0-re állítjuk be. A táptalajokat 30 percen át 121 °C hőmérsékleten autoklávozva sterilizáljuk, majd az egyes ferdeagar tenyészetekről készült szuszpenzióval oltjuk be, és New Brunswick rázógépen rázatjuk 7 napon át 28 °C hőmérsékleten. Az FD-28454 mutánst (ATCC 53 674) úgy detektáltuk, hogy a teljes tenyészet metil-izobutil-keton extraktumát vékonyrétegkromatográfiával vizsgáltuk. A sziükagél lemezen kifejlesztett kromatogramot vanillínes reagenssel permetezzük le, és 5 percen át 100 °C hőmérsékleten tartjuk. Az eluens 9 rész kloroformot és 1 rész metanolt tartalmaz. Rf értékek: UK-61689:0,3 körüli; UK-58852: 0,65 körüli. Az így kapott mutáns tenyészete UK-61689 és UK-58852 keverékét ter2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
