201804. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására mikrobiológiai úton
HU 201804B A találmány tárgya eljárás 2-keto-gulonsav előállítására a Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmus-törzs segítségével. A2-keto-L-gulonsavazL-aszkorbinsavelőállítási eljárásának fontos intermedier je. A 2-keto-L-gulonsavat korábban Reichstein [Helvetica Chimica Acta 17,311 (1934)] módszerével állították elő. Azonban az eljárás számoslépésből áll, nagymennyiségű oldószert igényel, ezért a modem technológia szempontjából nem megfelelő. Reichstein módszere helyett számos, mikroorganizmusok felhasználására alapozott módszert javasoltak. Például az egyik szerint glükózt 5-keto-D-gulonsawá oxidálnak egy mikroorganizmus segítségével, kémiai vagy mikrobiológiai úton L-idonsawá redukálják, majd a kapott vegyületet 2-keto-L-gulonsawá oxidálják mikrobiológiai úton (2,421,611 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Egy másik ismert eljárás szerint glükózt 2,5-diketo- D-glükonsawá oxidálnak egy mikroorganizmus segítségével, majd a kapott anyagot kémiai vagy mikrobiológiai módszerrel 2-keto-L-gulonsawá alakítják (közzétett japán 39-14493, 53-25033, 56- 15877 és 59-35920 sz. szabadalmi bejelentések). Azonban az ismert eljárások hátránya, hogy a kémiai redukciós eljárás, vagyis az 5-keto-D-glükonsav L-idonsawá, illetve a 2,5-diketo-D-glükonsav 2-keto-D-gulonsawá való átalakítása nem sztereospecifikus, így a redukció során melléktermékként képződött D-glükonsav, illetve 2-keto-D-gulonsav miatt a kívánt termék hozama csökken. Ezen kívül, ha a fenti reakciót egy mikroorganizmus segítségével hajtjuk végre, az összkitermelés akkor is csökken, mivel a mikrobiológiai eljárásban a kiindulási anyagként alkalmazott glükózt feleslegben kell alkalmaznunk, mivel ez a mikroorganizmus energiaforrása. Ebből a szempontból a kiindulási anyagként L-szorbózt alkalmazó 2-keto-L-gulonsav előállítására szolgáló eljárás csak oxidációs lépést tartalmaz. Számos, a Gluconobacter, Pseudomonas, Serratia, Achromobacter és Alcaligcnes nemzetséghez tartozó baktériumot vizsgáltak idáig a fenti reakcióban való alkalmasság szempontjából. Az üyen vizsgálatokat például a Biotechnology and Bioengineering 14,799 (1972), ActaMicrobiologicaSinica, 20, 246 (1980) és 27,185 (1981), 41-159 és 41-160 sz. közzétett japán szabadalmi leírás, 3,043,749 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint a 49-39838 sz. japán közzétett szabadalmi leírás tartalmazza. Azonban az ismert törzsekkel végzett eredmények nem kielégítőek, és a kitermelés túl alacsony ahhoz, hogy ipari méretekben érdemes legyen megvalósítani. Találmányunk kidolgozása során célunk az volt, hogy olyan eljárást dolgozzunk ki 2-keto-L-gulonsav előállítására, amely a korábban ismertetett eljárásokhoz képest nagyobb kitermelést eredményez. Vizsgálataink során arra a felismerésre jutottunk, hogy a fenti cél elérhető, ha az eljárásban K591s törzset alkalmazunk. AK591s törzset a Wakayama körzetből vett mintából izoláltuk. Úgy találtuk, hogy az eljárásban a Shiga körzetből vett földmintákból izolált 12-5, 12-15 és 12-4, 22-3 sz. baktéri1 umtörzsek is azonos eredménnyel alkalmazhatók. Taxonómiai vizsgálataink szerint ezek a törzsek új baktériumoknak bizonyultak, amelyek az irodalomból nem ismertek. A találmány tárgya tehát eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására L-szorbózból (1) Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmus segítségével, amely eredeti formájában vagy feldolgozva az L-szorbózt 2-keto-L-gulonsawá oxidálja, vagy (2) oly módon, hogy egy Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhoz tartozó mikroorganizmust, amely képes az L-szorbóz 2-keto-L-gulonsavvá való oxidálására, legalább egy, a Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacülus megaterium, BacU- lus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacülus subtüis, Pseudomonas trifolii, Pseumonoas matophüia, Proteus inconstans, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Erwinia herbicola, Xanthomonas pisi, Flavobacterium meningosepticum fajhoz tartozó mikroorganizmus jelenlétében L-szorbózzal hozunk érintkezésbe. A találmány szerinti eljárásban használt Pseudogluconobacter saccharoketogenes mikroorganizmus új, aerob mikroorganizmus, amely koenzim-A jelenlétében tenyészik. Afentiekben említett öt baktérium közül aK591s és 12-5 a következő taxonómiai tulajdonságokkal rendelkezik: a) Morfológia (1) Pálcika alakúak,méretük(0,3-0,5)x(0,7-1,4) pm. (2) Nem mutatnak celluláris polimorfiát. (3) 2-4 poláris flagella segítségével mozognak. (4) Nem képeznek spórákat. (5) Gram-negatív. (6) Nem saválló. b) Tenyészetési jellemzők (1) Semleges agar táptalaj: lényegében nincs növekedés. Élesztő-extraktummal dúsított agar táptalaj: kerek, teljes körvonalak, sima felület, opálos. (2) Élesztő-extraktummal dúsított, ferdére áhított agar: a növekedés mérsékelt és fonalszerű, finom, opálos. (3) Élesztő extraktumból készített folyékony tápközeg: Mérsékelt növekedés, egységes turbiditás az egész közegben. (4) Semleges zselatin szúrt tenyészet: Csekély felszíni növekedés, a zselatin nem folyósodik el. (5) Lakmusz tej: Megsavanyodás és koagulálódás. c) Fiziológiás tulajdonságok (1) Nitrát redukció: gyenge, de pozitív (2) Nitrátmentesítés: negatív (3) Metüvörös (MR) vizsgálat: pozitív (4) Voges-Proskauer vizsgálat: negatív (5) Indol: nem képződik (6) Hídrogén-szulfid: nem képződik (7) Keményítő: nem hidrolizálódik (8) Citromsav: nem hasznosítja (9) Ammónium-sók: hasznosítja (10) Pigmentek: nem képződnek 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
