201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B Szobahőmérsékleten 20 percen át tartó inkubálás után a lyukakat ismét kimossuk 2 csepp PBS-sel, glicerinben tárgylemezre helyezzük és UV-fényben 500-szoros nagyítással meghatározzuk a fluoreszcenciát. 11. példa CSP-reakció R16tet32-vel, R32tet32-vel és R48tet32-vel immunizált egerekből származó szérumok erős CSP- pozitív reakciókat adnak, amint az az 1. táblázat adataiból látható. Adjuváns nélkül alkalmazva csak az R16tet32-re nem termelődik olyan antitest, ami pozitív GSP-reakciót adna, míg CFA-val vagy alummal együtt adva mind a három találmány szerinti eljárással előállított protein olyan antitest-termelést indukál, amely erős CSP-reakciókat ad. 1. táblázat: R16tet32, R32tet32 ésR48tet32 elleni antiszérum CSP-reaktivitása 15 Adjuváns R16tet32 Antiszérum R32tet32 R48tet32-0/25(-) 17/25(2+) 21/25(4+) CFA 23/25(4+) 21/25(4+) 21/25(4+) alum 25/25(4+) 25/25(4+) 16/27(2+-4+) A CSP-reakciókat lényegében Vanderberg és munkatársai (MU. Med. 134(Supp. 1), 1183 /1969/) módszere szerint hajtjuk végre. 5 jjí mintát, amely 500-1000 moszkitó nyálmirigyből származó P. falciparum sporozitot tartalmaz Medium 199-ben újraszuszpendálva, mikroszkóp tárgylemezen 5 pl szérummal keverünk össze, vazelinnel szegélyezett zárólemezzel lefedjük és 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakciót fázis-kontraszt mikroszkóppal értékeljük ki, 400-szoros nagyítást alkalmazva. Minden egyes szérum-mintában 25 véletlenszerűen választott sporozoitot vizsgálunk meg, és feljegyezzük a CSP-pozitív organizmusok számát. A CSP-reaktivitás mértékét - Vanderberg és munkatársai fenti idézett módszere szerint meghatározva - zárójelben tüntetjük fel. A (-) érték azt jelenti, hogy nem észlelhető CSP-reaktivitás; (2+) szemcsés csapadék megjelenését jelenti a sporozoitok felületén; (4+) hosszú, fonalszerű fiiamén tűm megjelenését jelzi a sporozoitok egyik végén. A normál egérszérum, vagy a csak CFA-val immunizált egérből származó szérum nem vált ki kimutathatómértékű CSP-reakciót, párhuzamos vizsgálatokban. 12. példa Hepatocita-blokkolás A 9. példa szerinti szérumokat in vitro inváziógátlás szempontjából is megvizsgáljuk, az eredményeket a 2. táblázatban ismertetjük. 2. táblázat: P. falciparum sporozoitok HepG2 - Aló hepatoma sejtek elleni inváziójának gátlása Adjuváns Antiszérum 16 R16 R32 R48 — 46 95 92 CFA 76 92 94 alum 100 100 96 Az eredmények szerint az R32tet32 és R48tet32 proteinek erősen blokkoló hatású antitestek képződését indukálják, még adjuváns nélkül is. Az R16tet32 kevésbé hatásos erősen blokkoló hatású antitestek kiváltásában, csak alumhoz adszorbcálva fejt ki megfelelő hatást. Afenti eredmény összhangban van az R16tet32-re termelt antiszérum esetén megfigyelt gyenge CSP-reaktivitással és alacsony ELISA-titerekkel. A sporozoit-invázió gátlásának vizsgálatát tenyésztett sejteken lényegében Hollingdale és munkatársai (J. Immunoi. 32,909 /1984/) módszere szerint végezzük. Az R16tet32-vel, R32tet32-vel és R48tet32-vel immunizált egerekből nyert szérumot azon képessége szempontjából vizsgáljuk, hogy milyen mértékben tudja meggátolni A P. falciparum sporozoitok invázióját tenyésztett sejtek ellen. A szérumota tápközeggel hígítjuk és l:20-szorosvégső hígításban (térfogat/térfogat) HepG2-A16 sejttenyészethez (Am. J. Trop. Med. Hyg. 32, 682-684 (1983) adjuk. A tenyészetekhez ezután 12000- 40000 moszkitó nyálmirigyből nyert P. falciparum sporozoitot adunk és 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 37 ‘C-on 3 órán át inkubáljuk, Dulbecco-féle foszfáttal puffferőit sóoldattal (PBS) öblítjük, metanolban fixáljuk és PBS-sel kétszer öblítjük. Azokat a sporozoitokat, amelyek bejutottak a sejtbe, immunperoxidáz antitest vizsgálattal (IPA) tesszük láthatóvá (Hollingdale és munkatársai fent idézett munkája szerint). Az IPA vizsgálatot úgy végezzük, hogy a fixált tenyészetet először P. falcipa - rummal szembeni Mab-bal (2F1.1, lásd Dame és munkatársai fent idézett munkája) kezeljük, majd torma-peroxidázhoz kapcsolt nyúl anti-egér immun-globulinnal inkubáljuk és 3,3-diamino-benzidinnel megfestjük. A tenyésztett sejtekbe bejutott sporozoitok számát úgy határozzuk meg, hogy megszámoljuk a teljes preparátumban a sejten belüli parazitákat, Leitz mikroszkópot használva, 250-szeres nagyítás mellett, sötétkét színszűrővel. A vizsgálatokat vagy két, vagy három párhuzamos mintát vizsgálva hajtjuk végre, és minden egyes sejttenyészethez azonos számú sporozoitot adunk egy kísérletsorozaton belül. Agátlást a találmány szerinti polipeptidekkel szembeni immunszérum által kifejtett sporozoit-inváziós %-os csökkentésével adjuk meg, normál egérszérum kontrollokhoz viszonyítva, ahol a CS-reaktív Mab 2F1.1 100%-os gátlást fejt ki a sporozoit-invázió ellen, 1/20-as hígításban. A találmány szerinti eljárással előállított RLA, R16NS1 és R32NS1 rekombináns polipeptideket is hasonlóképpen vizsgáltuk, ELISA és IFA vizsgálatokkal, és azt tapasztaltuk, hogy azok hasonlóképpen olyan antitestet indukálnak, amely reagál a 16 aminosavból álló szintetikus polipeptiddel, és így pozitív CSP-reakciót adnak. Előnyösek az R32tet32 és R32LA proteinek, viszonylagos homogenitásuk, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
